產品分類
DNA實驗技術：分子克隆的常用載體
更新時間：2013-10-12 瀏覽次數(shù)：4929
DNA段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主復制，即必須具備復制原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在復制原點區(qū)域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆克隆，載體上常有篩選標記，如對抗菌素的抗性，某些基因產物的顯色反應等。
一、質粒
常用的有pBR322，pUC系列質粒等。
（一）pBR322質粒是4362bp的環(huán)狀雙鏈DNA載體，有2個抗藥性基因（四環(huán)素和氨芐青霉素），一個復制起始點和多個用于克隆 的限制酶切點。當缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322成功地轉化時，它便從該質粒獲得了抗生素抗性。兩個抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的單一酶切位點。一般只選一個抗生素基因作為插入外源DNA之用。外源DNA插入后該抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因則作為轉化細菌后篩選陽性克隆 之用。
（二）pUC系列質粒是2.7Kb的雙鏈DNA質粒，有一個復制起點，一個氨芐青霉素抗性基因和一個多克隆位點，多克隆位點處于表達LacZ基因產物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC質粒轉化LacZ基因有突變的大腸桿菌株（M15）時，因為由質粒表達的α－肽補充了大腸桿菌卻失的α－肽，所以恢復了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，長出藍色克隆。如果在多克隆位點內插入外源DNA，由于它破壞了α－肽的表達，因而在加入IPTG和X－gal的培養(yǎng)基，不能長出藍色克隆，這就是所謂的藍白篩選。
二、單鏈絲狀噬菌體和噬粒
（一）大腸桿菌絲狀噬菌體包括M13噬菌體f噬菌體等，其基因組 均是單鏈閉環(huán)DNA分子，其中M13mp系列克隆載體是對野生型M13加以改造，插入了多克隆位點和LacZ基因后的載體，所以也是可以利用IPTG和X-gal作藍白篩選的，M13感染大腸桿菌后，即在菌體內酶的作用下，以感染性單鏈DNA（正鏈）為模板，轉變?yōu)殡p鏈DNA，稱作復制型DNA（RF DNA）。一般當每一個細胞內有100-200個RF DNA拷貝時，即停止復制，產生有感染性的完整的單鏈絲狀噬菌體并分泌離開菌體。感染M13的大腸桿菌可繼續(xù)生長，并不發(fā)生裂解，但生長速度則較正常菌慢，取感染M13的細菌培養(yǎng)液離心，即可從菌體中提取RF DNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用；從離心后的上清液中，可用聚乙二醇（PEG）沉出噬菌體顆粒，提取單鏈DNA（ss DNA）供DNA序列分析，體外定位突變等使用。
（二）噬粒（phagemid）在質粒DNA中插入一段單鏈噬菌體的復制起始點DNA，即構成了噬粒，如pGEM-3Zf（-）就是一種噬粒。噬粒可像一般質粒一樣操作，但當需要制備單鏈DNA時，就需要在培養(yǎng)時加入輔助噬菌體，常用的輔助噬菌體有M13KO7和R408。培養(yǎng)好的菌液在離心除去菌體后，上清中加入PEG即可沉出含有單鏈DNA的顆粒。噬粒也常用于DNA序列分析和體外定位突變。分子克隆常用載體除了上述兩類以外，還有 噬菌體和粘粒，詳細情況可參閱有關資料。
- (上一篇)：線粒體的活體染色的及電鏡照片觀察
- (下一篇)：DNA實驗技術：基因組DNA甲基化分析方法