多克隆抗體的免疫電泳操作流程
更新時(shí)間：2016-08-03 瀏覽次數(shù)：3860
實(shí)驗(yàn)原理
免疫電泳又稱為γ球蛋白電泳或免疫球蛋白電泳技術(shù)，這是一種能夠判斷血液中三種免疫球蛋白IgM, IgG, IgA含量水平的實(shí)驗(yàn)方法。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，首先利用蛋白質(zhì)的分子量和所帶電荷的比值運(yùn)用水平瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，然后將特異性的抗體引入到與電泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗體的擴(kuò)散過程中，抗原和抗體適當(dāng)比例的結(jié)合會導(dǎo)致沉淀的產(chǎn)生。0.85%鹽不僅可以終止擴(kuò)散過程也可用于洗去未結(jié)合的蛋白，抗原和抗體結(jié)合所形成的沉淀線即可以肉眼觀察也可利用染色方法觀察。
免疫電泳技術(shù)不僅可用于血清或尿樣中單克隆抗體的鑒定，也可用于其它方面，比如免疫復(fù)合物的篩選、各種異常丙種球蛋白血癥的識別和鑒定等。免疫電泳技術(shù)也是進(jìn)行蛋白質(zhì)常規(guī)評價(jià)的一種可靠，的實(shí)驗(yàn)方法，可觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化和濃度的改變。
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 水平電泳儀
2. 打孔器
3. 滴管
4. 刀片
5. 電源
6. 水浴(55℃)
7. 燒杯(400-600ml)
8. 加樣槍(5-100μl)
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 純化的抗體;蛋白質(zhì)混合物;1%瓊脂。
2. Tris-巴比妥緩沖溶液：2.24g 巴比妥酸，4.43g Tris，0.053g 乳酸鈣及0.065g *溶于100ml 蒸餾水中。
3. 電泳緩沖溶液：將Tris-巴比妥緩沖溶液與蒸餾水按1：4的比例混合。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備瓊脂糖凝膠
將瓊脂和電泳緩沖溶液混合放入90℃水浴加熱至溶化，制成1%瓊脂，將瓊脂在冷卻前鋪在水平玻璃板上，待冷卻至室溫后，按圖用內(nèi)徑4毫米的打孔器打孔及制作凹槽。
2. 電泳
將用電泳緩沖溶液稀釋的4%-5%的抗原用滴管小心放入小孔中，將膠板放入電泳槽中并用潤濕的濾紙將膠板和電泳槽中的緩沖溶液相連。蓋上電泳槽蓋，接通電源，6V/cm通電至前沿移動約35mm，時(shí)間約為1小時(shí)，利用示蹤染料判斷移動距離。
3. 擴(kuò)散
將膠板移出電泳槽并放在水平位置上,用濾紙潤干膠板凹槽中的緩沖溶液,在凹槽中加入適量的抗體(0.2ml~0.25ml)，注意抗體不能溢出凹槽以避免污染.將膠板移至含有*且有一定濕度的盒內(nèi),加蓋密封后在30℃水浴擴(kuò)散至少10小時(shí)后，移至0.85%鹽水中以終止擴(kuò)散并洗去未結(jié)合的蛋白。
4. 觀察抗原和抗體之間所形成的沉淀線，并進(jìn)行記錄。
注意事項(xiàng)
1. 免疫電泳分析法的成功與否，主要取決于抗血清的質(zhì)量。抗血清中必須含有足夠的抗體，才能同被檢樣品中所有抗原物質(zhì)生成沉淀反應(yīng)。
2. 抗血清雖然含有對所有抗原物質(zhì)的相應(yīng)抗體，但抗體效價(jià)有高有低，因此要適當(dāng)考慮抗原孔徑的大小和抗體槽的距離。
3. 免疫電泳要求分析的物質(zhì)一方為抗原，另一方為沉淀反應(yīng)性抗體。因此沒有抗原性的物質(zhì)或抗原性差的物質(zhì)、非沉淀反應(yīng)性抗體，均不能用免疫電泳進(jìn)行分析。