柱離心法純化質粒DNA
更新時間：2015-06-25 瀏覽次數：2587
實驗原理
1. 離心柱結構：特殊硅基質吸附材料，特異性吸附DNA，而RNA與蛋白質穿過。
在正常情況下，核酸表面覆蓋了一層由水分子組成的親水薄膜，以維持其水溶性。高濃度鹽離子的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對有序排列，形成了疏水環境。在此環境中，核酸與硅膠膜能有效結合，而蛋白質、代謝產物和其他污染物則不能結合。
2. 堿變性抽提的原理是在pH高于12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，破壞了堿基配對，導致雙螺旋結構解開而變性，但閉環的質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態而不能彼此分開。當pH調至中性時，質粒DNA鏈迅速恢復到原來構型，仍保存于溶液中。而變性的染色體DNA不能再復性，通過離心，隨不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來，使兩者得以分離
實驗試劑
1. 試劑盒自帶溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
2. 漂洗液
3. 結合緩沖液
4. 洗脫緩沖液
5. TE buffer
實驗設備
1. 吸附柱
2. 取液槍
3. 離心機
4. 低壓電泳儀
5. 水平電泳槽
6. 紫外透射儀
實驗材料
帶有質粒的大腸桿菌
實驗步驟
1. 培養細菌：將帶有質粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應抗生素的液體培養基，37℃培養12～16小時；
2. 取液體培養液3ml(1.5mlX2)于Eppendorf管中，10000r/min離心1min，去掉上清液，加入100ml 溶液I，充分混勻；置冰上；
3. 加入150ml 溶液II，加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上放置1-2min；
4. 加入150 m l 溶液III，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min；
5. 用臺式高速離心機，12000r/min離心10min；
6. 吸附柱中加入420ul 結合緩沖液，將步驟5中的上清轉移至吸附柱中，蓋上收集管的蓋子，混勻， 12000r/min離心1min；
7. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul 漂洗液 , 靜置1 min，12000r/min離心30 s；
8. 重復步驟7一次；
9. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，12000r/min離心2min；
10. 吸附柱放入一個新的1.5ML離心管，在吸附柱的中央加40ul洗脫緩沖液或 TE buffer,室溫放置3-5分鐘。蓋好蓋子12000rpm 離心1分鐘，收集質粒DNA溶液。
11. 取5ul 電泳檢查，(100ml凝膠加入5ul 染料)。
注意事項
加樣時要排出槍頭中的空氣，以免攪動液面。
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