用DNA 芯片技術檢測基因的表達
更新時間：2015-06-02 瀏覽次數：2109
一、芯片制備
基因芯片的制備主要有兩種基本方法，一是在片合成法，另一種方法是點樣法。在片合成法是基于組合化學的合成原理,它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學單體的偶聯位點和次序。在片合成法制備DNA芯片的關鍵是高空間分辨率的模板定位技術和固相合成化學技術的精巧結合。目前，已有多種模板技術用于基因芯片的在片合成,如光去保護并行合成法、光刻膠保護合成法、微流體模板固相合成技術、分子印章多次壓印原位合成的方法、噴印合成法。在片合成法可以發揮微細加工技術的優勢，很適合制作大規模DNA探針陣列芯片，實現高密度芯片的標準化和規模化生產。美國Affymetrix公司制備的基因芯片產品在1.28*1.28cm2表面上可包含300,000個20至25mer寡核苷酸探針，每個探針單元的大小為10um X 10um。其實驗室芯片的陣列數已超過到1,000,000個探針。
基因芯片點樣法首先按常規方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭, 分別把不同的探針溶液，逐點分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點,并通過物理和化學的結合使探針被固定于芯片的相應位點。這種方式較靈活，探針片段可來自多個途徑，除了可使用寡聚核苷酸探針，也可使用較長的基因片段以及核酸類似物探針（如PNA等）。探針制備方法可以用常規DNA探針合成方法、或PCR擴增的cDNA、EST文庫等。固定的方式也多種多樣。點樣法的*性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和儀器或cDNA探針庫，探針的長度可以任意選擇，且固定方法也比較成熟，靈活性大適合于研究單位根據需要自行制備科研型基因芯片，制作點陣規模較小的商品基因芯片。
二、靶基因樣品的制備
與普通分子生物學實驗一樣，靶基因的制備需要運用常規手段從細胞和組織中提取模板分子，進行模板的擴增和標記。基因芯片包括大量探針分子，因此，靶基因樣品的制備方法將根據基因芯片的類型和所研究的對象(如mRNA 、DNA等)而決定。對于大多數基因來說，mRNA 的表達水平大致與其蛋白質的水平相對應，因此，對細胞內mRNA 表達水平進行定量檢測對于了解細胞的性質與狀態十分重要。用基因芯片可以對細胞內大量基因的mRNA表達差異進行檢測，其靶基因的制備一般采用RT-PCR方法以寡聚dT作引物進行擴增。
待測樣品的標記，主要采用熒光分子。常規標記的過程是通過在擴增過程中加入含有熒光標記的dNTP（至少一種為熒光標記的），熒光標記的單核苷酸分子，在轉錄和復制過程中，被引入新合成的DNA片段。后者變性后，即可與基因芯片上的微探針陣列進行分子雜交。也可采用末端標記法，直接在引物上標記熒光。即在引物合成時通過應用熒光標記的dNTP制備熒光標記引物，或通過標記生物素，進行熒光標記。
對于陣列密度較小的基因芯片(經常用膜片作為基底)可以用同位素檢測法，采用32P標記技術，這樣可以運用現在普通使用的同位素顯影技術和儀器。但是，在使用同位素靶基因標記法過程中，一些表達量高雜交信號強的點陣，容易在其周圍產生光暈，當其周圍點陣的雜交信號較弱時，其雜交信號容易受到強雜交信號的掩蓋。
三、靶基因的雜交及其信號的檢測
cDNA基因芯片與靶基因的雜交過程與一般常規的分子雜交過程基本相同。在基因芯片的雜交檢測中，為了更好的比較不同來源樣品的基因表達差異，或者為了提高基因芯片檢測的準確性和測量范圍，通常使用多色熒光技術。即把不同來源的靶基因用不同激發波長的的熒光探針來修飾，并同時使它們與基因芯片雜交。通過比較芯片上不同波長熒光的分布圖，可以直接獲得不同樣品中基因表達的差異。
人們還發展了其它靈敏度高、特異性好的基因芯片雜交檢測方法。例如短序列偶聯法。該方法首先將非標記的DNA靶序列與基因芯片上探針陣列進行*雜交，若基因芯片上探針的固定端是5’端時，繼續以靶基因為模板，可以在暴露于溶液中的3’-OH上用DNA聚合酶合成上新的帶有熒光標記的堿基（ddNTPs）。通過檢測ddNTP可以分辨出靶序列的基因。
美國Nanogen公司提出了一種通過交變電場加速基因芯片的雜交速度的主動式基因芯片。他們利用核酸分子所帶的負電性質，通過快速反轉電場的極性，使靶基因與探針間產生快速結合和分離。通過控制電場的大小，使得*匹配雜交的核酸分子保留在陣列表面，而非特異性結合的DNA在電場的作用下與探針分離。這種芯片的分子雜交速度可縮短至1分鐘以下甚至數秒（cheng et al，1998），因此有較廣闊的應用前景。
- (上一篇)：植物葉片光合速率的測定（改良半葉法）
- (下一篇)：淋巴細胞的分離和激化實驗