Real-Time PCR實驗流程
更新時間：2015-04-01 瀏覽次數(shù)：1922
實驗試劑
Total RNA Kit ：Omega：(Cat.No．R6834)
First Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia(Cat.No．C0210A)
2xAllinOneTMQ-PCRMix：GeneCopoeia（cat.No．D0101A)
Primer synthesis：invitrogen
實驗設(shè)備
Real Time PCR：ABI
實驗材料
樣品為5個人源的細胞培養(yǎng)液，其編號分別為：NO.I、No.2、No.3、No.4、No.5，其中為對照組，其它四個為不同的樣品組。
實驗步驟
1. RNA抽提
1) 樣品處理：取適量樣本加入 1ml TRK 裂解液勻漿樣品。室溫 14,000 × g 離心 5 min去除不溶解的的雜質(zhì)，小心轉(zhuǎn)移上清至 1.5ml 離心管。
2) 加入等倍體積 70% 乙醇至裂解液中，抽打或渦旋混勻。
3) 將柱子套在收集管中，轉(zhuǎn)移混合液至柱子中。室溫 10,000 × g 離心 30-60 秒，棄去濾液。
4) 把柱套放新收集管中，加入 300ul RNA Wash Buffer I 至柱子上，按以上條件離心，棄去濾液。把柱套放回收集管中。
5) DNase 消化: 配制 DNASE 消化液( Digestion Buffer, 73.5ul ; RNase-Free DNase I,1.5ul) ,混勻, 將消化液轉(zhuǎn)移至柱子膜的正中央，室溫靜置 15 分鐘。
6) 加 500ul RNA Wash Buffer I 至柱子，按以上條件離心，棄濾液。
7) 把柱套放回收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上條件離心，棄濾液。
8) 把柱套放回新收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上條件離心，棄濾液。
9) 把柱套放回收集管中， 10,000xg 離心空柱 2min 以甩干柱子基質(zhì)。
10) 把柱子裝在 1.5ml 離心管上，加入 30-100ul DEPC Water 柱子基質(zhì)上，室溫靜置 2min 。10,000xg 離心 1min 洗脫出 RNA 。
11) RNA濃度測定
吸取lul抽提的RNA用DEPC水稀釋10倍后．在Nanodrop上測定RNA濃度，以DEPC水做空白對照，同時記錄RNA濃度及其OD260／OD280。
2. RNA電泳檢測
1) 變性膠制備
取1gAgarose 75ml去離子水煮沸，冷卻至70℃左右加入10ml 10×Mops和15ml 甲醛及EB。倒膠至寬口梳子的膠板上，蓋上蓋子。
2) 電泳緩沖液配制(1×Mops)
取50ml 10×Mops。用去離子水稀釋至500ml，倒入電泳槽中，再在電泳緩沖液中添加EB。
3) RNA樣品處理
取RNA 樣品3u1．10×Mops 2u1．zui后補充DEPC 水至20ul，65℃變性10min 后立即冷卻．加入2ul 10×RNA loadingbuffer即可電泳。
4) RNA電冰
先把RNA 膠放入電泳槽中，100V 作用電泳約5min，再在點樣孔中點入處理過的RNA 樣品，100V左右電泳至溴酚藍至膠的2／3處，取膠拍照。
3. 反轉(zhuǎn)錄
1) 融解反應(yīng)所需的試劑，上下輕微顛倒混勻，進行短暫離心后放置冰上待用。
2) RNA-Primer Mix的配制反應(yīng)（所有反應(yīng)液的配制都在冰上操作）在預冷的RNase free 的反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積13μl。
試劑組分 體積 終濃度
Total RNA 1μg
60μM Oligo（dT）18 1μL 2.4μM
DEPC 水 至總體積13μl
3) RNA變性
混勻RNA-Primer Mix，進行短暫離心，65℃變性10min后立即放置冰上。
4) 配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
在RNA-Primer Mix反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積25μl。
試劑組分 體積 終濃度
RNA-Primer Mix 13μl
5×RT Reaction Buffer 5μl 1×
25mM dNTP 1μl 1mM
25U/μl RNase Inhibitor 1μl 1U/μl
200U/μl M-MLV RTase 1μl 8U/μl
DEPC水 4μl
總體積 25μl
5) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
混勻反應(yīng)Mix，短暫離心后42℃孵育1h。
6) 滅活并保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物
反應(yīng)結(jié)束后，85℃滅活處理5min，zui后-20℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
4. 定量PCR實驗
采用染料法（SYBR Green I）進行相對定量分析，實驗設(shè)計是按照ΔΔCt解析法來進行設(shè)計。實驗步驟如下：
1) 將2XAllinOneTMQ—PCR Mix在室溫下融解．輕柔得上下顛倒混勻并進行短暫離心。同時在使用過程中始終保持避光。
2) PCR reaction mix的制備 (在冰上操作)
試劑 用量 終濃度
2XAllinOneTMQ—PCR Mix 10μl 1×
ddH2O 1μl
PCR Forward Primer（4μM） 2μl 0.4μM
PCR Reverse Primer（4μM） 2μl 0.4μM
cDNA 5μl
總體積 20μl
注意：在實驗中也設(shè)計了NTC(No Template Control)，其為陰性對照，即在反應(yīng)中用水來代替模板cDNA，其它試劑不變．從而來質(zhì)控是否體系有污染。迅速將PCR reaction mix稍混勻，并加入8聯(lián)管中。
3) 將8聯(lián)管進行短暫離心，確保所有反應(yīng)液在反應(yīng)孔底部。
4) PCR 反應(yīng)，采用了標準的三步法程序進行反應(yīng)：
循環(huán)數(shù) 步驟 溫度 時間 檢測
1 預變性 95℃ 10min Off
40 變性 95℃ 10sec Off
退火 57℃ 20sec Off
延伸 72℃ 15sec On
5) 在PCR 反應(yīng)后．采用以下的程序進行熔解曲線分析
溫度 溫度間隔 時間 檢測
72℃~95℃ 0.5℃ 6sec/each On
30℃ 30sec off
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