質(zhì)粒抽提過程中內(nèi)毒素如何去除？
更新時(shí)間：2022-05-28 瀏覽次數(shù)：2766
| 內(nèi)毒素，即脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）細(xì)胞膜的組成部分。細(xì)菌外膜的外層脂質(zhì)部分是*由內(nèi)毒素分子所構(gòu)成的。單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞約包含兩百萬個(gè)LPS分子，每個(gè)LPS分子由疏水的脂質(zhì)A（lipid A）部分、復(fù)雜的糖類殘基陣列部分及負(fù)電性的磷酸基團(tuán)所組成。因此，每個(gè)內(nèi)毒素分子都具有疏水域、親水域和電荷域，這使它在與其他分子相互作用時(shí)具有其*的自身性質(zhì)。細(xì)菌在其活性生長(zhǎng)期向其周圍微環(huán)境中散布少量的內(nèi)毒素，在死亡時(shí)則釋放大量?jī)?nèi)毒素。 在質(zhì)粒制備的細(xì)菌細(xì)胞裂解過程中，內(nèi)毒素分子被從外膜釋放到溶菌液中。 |  大腸桿菌細(xì)胞膜示意圖 | ||||||||||||||||||
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| 內(nèi)毒素會(huì)對(duì)原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染過程造成重要影響，內(nèi)毒素水平的升高會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的急劇下降。而且，使用不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA對(duì)于基因治療的相關(guān)應(yīng)用至關(guān)重要，因?yàn)閮?nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致發(fā)熱、內(nèi)毒素性休克綜合癥，并會(huì)在動(dòng)物和人體上激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。內(nèi)毒素也會(huì)干擾如巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞一類免疫細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致免疫反應(yīng)的非特異性激活。這些效應(yīng)還包括對(duì)如IL-1和前列腺素等免疫介質(zhì)的誘導(dǎo)性合成。為了避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)誤判斷，確保塑料制品、培養(yǎng)基、血清和質(zhì)粒DNA中均無LPS污染十分重要。 | |||||||||||||||||||
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| 內(nèi)毒素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，以及它們形成膠束結(jié)構(gòu)的傾向性，都使得它們?nèi)菀着c質(zhì)粒DNA共同被純化出來。例如，在CsCl超速離心法當(dāng)中，CsCl結(jié)合的DNA很容易被內(nèi)毒素分子所污染，因?yàn)樵贑sCl中內(nèi)毒素與質(zhì)粒——溴化乙錠復(fù)合物具有相似的密度。 在大尺寸DNA純化樹脂上，高分子量膠束樣內(nèi)毒素很類似于高分子量的DNA分子；在陰離子交換色譜法當(dāng)中，內(nèi)毒素分子上的負(fù)電荷能夠與陰離子交換樹脂相互作用，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA被共同純化下來。不過，質(zhì)粒DNA中內(nèi)毒素污染的水平很大程度上依賴于所使用的純化方法。QIAGEN Plasmid Kit和2xCsCl梯度離心法均能夠生成較低內(nèi)毒素含量的高純度DNA。硅膠懸漿法純化出的DNA則含有顯著升高的內(nèi)毒素污染。使用EndoFree Plasmid Kit抽提出的DNA僅含有可忽略不計(jì)的微量?jī)?nèi)毒素（<0.1EU /μg質(zhì)粒DNA）。 各種質(zhì)粒制備方法的內(nèi)毒素污染與轉(zhuǎn)染效率*
* 宿主株系: DH5α; 質(zhì)粒: pRSVcat. ;? 1 ng LPS = 1.8 EU. | |||||||||||||||||||
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| 由于內(nèi)毒素與鱟（Limulus polyphemus，馬蹄蟹）變形細(xì)胞中的可凝蛋白之間存在凝固反應(yīng)，因此歷*一般通過此凝固反應(yīng)對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行檢測(cè)。今天人們則使用更為敏感的光度試驗(yàn)（例如BioWhittaker公司所提供的動(dòng)力學(xué)-QCL檢測(cè)），這類方法基于對(duì)鱟變形細(xì)胞裂解液（LAL），以及一種合成的生色底物的使用。LPS污染通常以內(nèi)毒素單位（EU）來表示。通常1 ng LPS對(duì)應(yīng)1–10 EU。 | |||||||||||||||||||
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| 獲得的EndoFree Plasmid制備方法在標(biāo)準(zhǔn)的QIAGEN Plasmid純化方案中整合了對(duì)內(nèi)毒素的去除步驟。使用QIAfilter Cartridge過濾中性的細(xì)菌裂解液，并加入專門的不含內(nèi)毒素緩沖液（緩沖液ER）在冰上進(jìn)行共同孵育。不含內(nèi)毒素緩沖液能夠避免LPS分子與QIAGEN-tip中的樹脂結(jié)合，從而使每微克質(zhì)粒DNA中含有的內(nèi)毒素少于0.1EU。 以上信息來源于QIAGEN： http://www.qiagen。。ｃｏｍ/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/removal%20of%20bacterial%20endotoxins/ 如需更多相關(guān)產(chǎn)品信息，請(qǐng)登錄查詢。 www.bnbiotech。。ｃｏｍ
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