細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解答
更新時間：2014-11-25 瀏覽次數(shù)：2461
1 冷凍管應(yīng)如何解凍?
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。
2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應(yīng)馬上去除DMSO?
除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞)， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。
3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無法存活。
4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類?
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
6 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。
7 何時須更換培養(yǎng)基?
視細(xì)胞生長密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。
8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?
除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
9 附著性細(xì)胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理?
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機(jī)會。
10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。
11 欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?
欲回收動物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。
12 細(xì)胞之接種密度為何?
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。
13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?
動物細(xì)胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。
14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?
冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況， *次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。
15 冷凍保存細(xì)胞之方法?
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微
降低一些。
16 細(xì)胞欲冷凍保存時， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染?
細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。
18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理?
直接滅菌后丟棄之。
19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀?
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，
無法以其外觀分辨之。
20 支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
21 偵測出細(xì)胞株有支原體污染時， 該如何處理?
直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。
22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中，顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性?
培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。
24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同?
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。
25 購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形?
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
26 購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于–80 °C 太久。
27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因?
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。
另：這里補(bǔ)充一下培養(yǎng)用品的消毒，供參考：
細(xì)胞培養(yǎng)的zui大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不*，由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。
消毒方法分為三類：
(A) 物理滅菌法(紫外線、濕熱、過渣等);
(B) 化學(xué)滅菌法(各種化學(xué)消毒劑);
(C) 抗生素。
(1)紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌，培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過2.5米，且消毒進(jìn)物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。
紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。
(2)溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀荆且环N使用zui廣泛、效果的消毒方法。溫?zé)嵯緯r，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，同時檢驗(yàn)安全閥活動自如，繼后開始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時，開始記算消毒時間。消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發(fā)生。
常用物品消毒壓力及時間：
培養(yǎng)液、橡膠制品、10磅10分鐘;
布類、玻璃制品、金屬器械、18磅20分鐘。
上兩種是zui常見的物理消毒方法。
(3)化學(xué)消毒法：zui常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。化學(xué)消毒法操作簡單、方便有效。
(4)抗生素消毒：確切應(yīng)記成抗生素滅菌，主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。
如果已經(jīng)發(fā)生真菌污染，原則上應(yīng)盡快丟棄，但是如果是比較珍貴的細(xì)胞系，可以用抗真菌藥物來嘗試搶救，用一般用量的5～10倍來沖擊治療，24～28h后換常規(guī)培養(yǎng)液。但是這種方法一般只是在污染早期才有效!
35.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。
44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎?
一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。
45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎?
大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。
46.為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?
胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。
47.保存血清的方法?
我們建議血清應(yīng)保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。
48. 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?
將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。
49. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?
血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。
若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙枞^濾膜。
50. 為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。
51. 有必要做熱滅活嗎?
實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或*沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。
若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質(zhì)量!
52. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?
有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預(yù)老化，儲存在2-8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在-20℃儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。
53. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?
我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:
(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。
(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。
(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。
(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。
(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。
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