植物學技術(shù)：細胞傷口愈合實驗
更新時間：2014-11-06 瀏覽次數(shù)：2054
原理：
細胞傷口愈合實驗被研究者廣泛應(yīng)用和改進，用來研究各種實驗條件比如基因敲除和化療在細胞遷移和增殖中的作用。該實驗操作簡單，費用廉價，實驗條件容易根據(jù)不同的目的改進。該方法的基本原理是，在單層培養(yǎng)細胞間制作劃痕以產(chǎn)生愈傷區(qū)域，然后監(jiān)控該傷口周圍細胞的向劃痕遷移的現(xiàn)象，即傷口愈合。改變細胞遷移和/或生長的因素可以增加或降低傷口愈合率。該方法可以定量，適用于自動化系統(tǒng)高通量篩選。
材料和儀器：
1.人MDA-MB-231cell(ATCC#HTB-26)
2.DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen#10313-021)
3.胎牛血清(ATCC#30-2020)
4.PBS(Invitrogen#14190-144)
5.BD24孔細胞培養(yǎng)板(Fisher#08-772-1H;BD#353226)
6.Raininpipettips,1ml(Rainin#GPS-L1000)
7.戊二醛(Sigma-Aldrich#G6257)
8.乙醇(Sigma-Aldrich#459836)
9.結(jié)晶紫(Sigma-AldrichC3886)
10.細胞培養(yǎng)儀：37°Cand5%CO2
步驟：
1.細胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中生長。
2.細胞以一定密度接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，生長24小時后，單層細胞融合度應(yīng)達到70-80%。
3.不要更換培養(yǎng)基。用新的1ml槍頭輕輕的在單層培養(yǎng)細胞間劃痕，劃痕橫穿過孔，槍頭盡量與板孔的底部垂直，不要傾斜。這樣產(chǎn)生的gap的距離才與槍頭末端的外直徑相等。Gap的距離可以選用不同型號的槍頭調(diào)節(jié)。劃痕在同一方向成一條直線。
4.在垂直與*條劃痕的方向制作另一條劃痕，每孔劃痕成十字交叉型。
5.劃痕后，用培養(yǎng)基輕輕的清洗板孔2次，以去除脫落細胞。
6.每孔添加新鮮培養(yǎng)基。
7.(培養(yǎng)基中含有某些成分，如抑制/促進細胞遷移和/或增殖的化學物質(zhì))
8.細胞生長48小時(或根據(jù)時間需要).
9.1xPBS清洗細胞兩次，然后使用3.7%多聚甲醛固定30分鐘。
10.10.1%的結(jié)晶紫（2%乙醇溶解）染色30分鐘。
11.染色的單層細胞選取不同的視野，顯微鏡拍照。gap的距離可通過Photoshop或ImagJ軟件測量.為了降低實驗結(jié)果的可變性，建議每孔選擇多個視野觀察，每組做多個重復(fù)。