微生物學技術:PCR法檢測支原體
更新時間：2014-08-14 瀏覽次數：1492
PCR法是20世紀80年代中期建立起來的一種體外DNA擴增技術，其基本原理是酶促DNA合成反應，即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經DNA聚合酶的作用，使DNA 鏈擴增延伸。該方法具有靈敏度高、特異性強、快速的特點，但其對實驗環境的要求嚴格，實驗成本較高，有時還有假陽性的現象出現。
1、儀器設備
超凈工作臺、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統、臺式離心機、旋渦混懸器等。
2、實驗試劑
選用美國Stratagene公司生產的支原體檢測試劑盒（內有引物、陽性對照、內對照、StrataClean resin、緩沖液），dNTP，TapDNA聚合酶，緩沖液，瓊脂糖，礦物油。
3、實驗操作
PCR反應的前期操作應在無菌環境中進行。
（1）樣品的收集：待測細胞用抗培養基培養7d，用無菌容器取上清液500ul，4℃保存待測。
（2）模板的制作：在無菌的條件下，取細胞培養上清100ul于一無菌的0.5ml塑料離心管內，蓋好蓋子，95℃水浴加熱5min。
（3）打開蓋子，向管內加StrataClean resin10ul，蓋好蓋子，旋渦混懸器混合，離心5—10s，吸取上清至一新的塑料離心管中，模板制作完畢，4℃保存。
（4）PCR反應：反應體系zui適條件為：10mmol/lTris-HCL（pH8.38）；50mmol/lHCL；1.5-2.5mmol/lMgCL2；200umol/ldNTP；2UDapDNA聚合酶。總反應體系為50ul，反應用去離子水均需用12000uw/cm2紫外燈照射。反應如下表：
表 反應程序
| 程 序 | 循 環 | 溫度/℃ | 時間/min |
| 94 | 2 | ||
| 1 | 1 | 50 | 2 |
| 72 | 2 | ||
| 94 | 1 | ||
| 2 | 40 | 50 | 1 |
| 72 | 2 |
①在0.5ml塑料離心管中加入35.2ul去離子水及5ul*10Taq反應緩沖液。
②依次加入下列成分：0.4uldNTPs（25mmol/l），0.4ulTaqDNA聚合酶（5U/ul），2ul引物。
③加2ul去離子水，總體積45ul。
④加2ul已制成的模板到反應體系中。
⑤陽性對照，內對照各5ul加入到各自的反應體系中。
⑥取一支含有以上反應體系的離心管，加入5ul去離子水作為陰性對照管。
⑦在反應體系中加入100ul礦物油。
（5）瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度2%。電泳結束后，凝膠成像分析結果。
（6）結果分析：該方法為檢測支原體的定性方法，在電泳泳道上，MARKER、陽性對照、內對照均會出現不同的電泳條帶，當被檢樣品泳道出現明亮條帶，且位置在陽性對照和陰性對照條帶位置之間，即可認為該樣品被支原體污染。有時還會發現一條泳道出現多條，可能是該樣品感染兩種以上支原體所致。如果泳道內條帶隱約出現，則可懷疑有支原體污染，重做該樣品。
- (上一篇)：微生物學技術：用比濁法測定大腸桿菌的生長曲線
- (下一篇)：微生物學技術：高壓蒸汽滅菌實驗