微生物學(xué)技術(shù)：微生物鑒定中常用的生化反應(yīng)
更新時(shí)間：2014-08-12 瀏覽次數(shù)：1397
實(shí)驗(yàn)原理
有些細(xì)菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色。
細(xì)菌產(chǎn)生的脂肪酶能分解培養(yǎng)基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培養(yǎng)基pH下降，可通過在油脂培養(yǎng)基中加入中性紅做指示劑進(jìn)行測試。中性紅指示范圍為pH6.8（紅）～8.0（黃）。當(dāng)細(xì)菌分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸時(shí)，則菌落周圍培養(yǎng)基中出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。
某些細(xì)菌分泌蛋白酶分解明膠，產(chǎn)生小分子物質(zhì)。如果細(xì)菌具有分解明膠的能力，則培養(yǎng)基可由原來固體狀態(tài)變成液體狀態(tài)。
牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。細(xì)菌對牛乳的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊中性時(shí)呈淡紫色，酸性時(shí)呈紅色，堿性時(shí)呈藍(lán)色，還原時(shí)則部分或全部脫色。細(xì)菌對牛乳的利用可分三種情況：
（1）酸凝固作用：細(xì)菌發(fā)酵乳糖后，產(chǎn)生許多酸，使石蕊牛乳變紅，當(dāng)酸度很高時(shí)，可使牛乳凝固，此稱為酸凝固。
（2）凝乳酶凝固作用：某些細(xì)菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，這種凝固在中性環(huán)境中發(fā)生。通常這種細(xì)菌還具有水解蛋白質(zhì)的能力，因而產(chǎn)生氨等堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)。
（3）胨化作用：酪蛋白被水解，使牛乳變成清亮透明的液體。胨化作用可以在酸性條件下或堿性條件下進(jìn)行，一般石蕊色素被還原褪色。
實(shí)驗(yàn)材料
1、活材料：大腸桿菌（E. coli）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、黏乳產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes viscolactis）、銅綠假單胞菌（Psudomonas aeruginosa）、普通變形桿菌（Proteus vularis ）。
2、培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加0.2%的可溶性淀粉；油脂培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加花生油10mL、0.6%中性紅水溶液1mL；明膠液化培養(yǎng)基：蛋白胨5g，明膠100～150g，水1000mL, pH7.2～7.4，115℃滅菌20min。石蕊牛乳培養(yǎng)基：牛奶粉100g、石蕊0.075g、水1000 mL、pH6.8，121℃滅菌15 min 。
3、試劑：盧哥氏碘液。
實(shí)驗(yàn)用品
平皿、接種環(huán)、酒精燈、試管、接種針等。
實(shí)驗(yàn)方法
（一）淀粉水解試驗(yàn)
1、準(zhǔn)備淀粉培養(yǎng)基平板：將熔化后冷卻至50℃左右的淀粉培養(yǎng)基倒入無菌平皿中，待凝固后制成平板。
2、接種：用記號筆在平板底部劃成兩部分，在每部分分別寫上菌名，用接種環(huán)取少量的待測菌，點(diǎn)接在培養(yǎng)基表面的相對應(yīng)部分的中心，其中一個(gè)菌種應(yīng)是枯草桿菌做對照菌?！锬隳芙忉屧騿?？
3、培養(yǎng)：將接種后的平皿置于28℃恒溫箱培養(yǎng)24h。
4、檢測：取出平板，打開平皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。菌落周圍如出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已經(jīng)被水解，表示該細(xì)菌具有分解淀粉的能力?？梢杂猛该魅Υ笮≌f明測試菌株水解淀粉能力的強(qiáng)弱。
（二）油脂水解試驗(yàn)
1、將裝有油脂培養(yǎng)基的三角瓶置于沸水浴中熔化，取出并充分振蕩，使油脂均勻分布，再傾入無菌平皿中，待凝固成平板。
2、接種：于同一平皿的兩邊接種，其中一種是金黃色葡萄球菌作為對照菌。置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，取出后觀察平板菌苔顏色，如果出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，即說明脂肪被水解了，此反應(yīng)為正反應(yīng)。紅色斑點(diǎn)大小說明測試菌株水解脂肪能力的強(qiáng)弱。
（三）明膠液化試驗(yàn)
1、接種：用穿刺接種法接種大腸桿菌或產(chǎn)氣腸桿菌于明膠培養(yǎng)基中。
2、培養(yǎng)：放20℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。若細(xì)菌在20℃下不長，則應(yīng)放在zui適溫度下培養(yǎng)。
3、觀察結(jié)果：觀察培養(yǎng)基有無液化情況及液化后的形狀。
因明膠在低于20℃時(shí)凝固，高于25℃時(shí)自行液化，若是在高于20℃下培養(yǎng)的細(xì)菌，觀察時(shí)應(yīng)放在冰浴中觀察，若明膠被細(xì)菌液化，即使在低溫下明膠也不會再凝固。
（四）石蕊牛乳試驗(yàn)
1、接種：將黏乳產(chǎn)堿桿菌和銅綠假單胞菌接種入石蕊牛乳培養(yǎng)基中。
2、培養(yǎng)：將接種后的試管于37℃恒溫培養(yǎng)7d，另外保留一支不接種的石蕊牛乳培養(yǎng)基作為對照。
3、結(jié)果觀察：取出培養(yǎng)物，以不接種任何細(xì)菌的試管為對照，觀察接種不同細(xì)菌生長后的變化情況。