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圖1. 雙抗體夾心法測抗原示意圖
 

本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結合，經保溫孵育洗滌后，即可加入酶標記特異性抗體，再經孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
 

這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。

血清 血漿 體液

碳酸鹽包被緩沖液 抗體球蛋白 吐溫 檸檬酸 硫酸

酶標比色計 96孔板 移液槍 離心管 離心管盒

一、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至zui適濃度（1～10 μg /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過，或37℃水浴3小時，貯存冰箱。

二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 

三、每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標本，37℃作用1～2小時。

四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

五、加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標記特異性抗體溶液，37℃作用1～2小時或由預試實驗確定作用時間。

六、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

七、加入0.2ml底物溶液于每個凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。

八、加終止劑：每凹孔加2M H₂SO₄或2 M檸檬酸0.05 ml。

九、觀察記錄結果：目測或用酶標比色計測定（OPD用492nm）OD值。

一、ELISA的影響因素

1.  固相載體

可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質可作為固相載體，如纖維素、交聯右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中zui常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。

由于微量反應板所用試劑量少，操作方便，適合于大規模應用。國產聚苯乙烯微量反應板（上海塑料三廠出品）目前已大量應用于ELISA測定，并且獲得了滿意的結果。但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質的吸附性能是有顯著差別的。實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表面性質有關。特別是塑料制品在加工過程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至*喪失吸附能力。

因此，對每批制品在使用前，必須經過實驗室鑒定，鑒定的方法和標準是對每批購置的微量反應板或塑料管抽樣，用0.2 ug/ml純化的正常人IgG進行包被，經洗滌后加酶標記抗人球蛋白進行反應，再經孵育洗滌，加底物顯色終止反應后，逐孔在酶標比色計中測定其消光值、光密度（OD值）。一般認為全板中每兩孔間OD值的誤差不超過10%為合格。如果中間孔與四周孔OD值相差太大，或者反應板的這一邊與另一邊凹孔的OD值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽性和陰性參考血清OD值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格，微量反應板或塑料管在使用前并不一定通過特殊處理。用蒸餾水沖洗即可應用。

2.  抗原

在ELISA中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學活性。

經試驗證明，適用于其他血清學試驗的抗原并非均適合用于ELISA法。因此，對某一疾病的診斷，必須通過實踐，才能選出適用的抗原。對大多數傳染病和寄生蟲病的血清學診斷中所用的抗原并非要求十分嚴格，一般能用于補體結合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超聲波抗原、凍融抗原、細菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、細菌的外毒素以及用表面活性劑(如SDS)所提取的抗原等，在作ELISA時，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。

此外，對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養和雞胚培養物以及病毒接種動物的臟器等，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時選擇的濃度要適當。如濃度太高，則低效價抗體可能測不出來，或包被過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重復性。

用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經濟，而且可以克服前帶現象。那么用多大濃度抗原進行包被zui為合適呢？可通過棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結合物進行反應，經孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定OD值，選擇OD值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。

抗原包被固相載體除濃度外，對時間、溫度、PH均有關系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過，可使抗原吸附得更加*且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質的濃度為1-10 ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適，但均應通過滴定。