細胞技術專題：原代胚胎成纖維細胞培養
更新時間：2014-04-17 瀏覽次數：1324
實驗器材
手術小直剪刀三把、眼科直鑷子三把、眼科彎鑷子兩把、玻璃平 皿三套、200目尼龍濾網、50ML、15ML離心管和手術刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。
實驗試劑
無Ca2+和Mg2+的 PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纖維細胞（MEF）生長培養基：高糖DMEM加10%FCS。
實驗動物
孕期14至16天的孕鼠
實驗步驟
1. 處死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超凈臺中用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開，用另外一把剪刀和一把鑷子把內皮剪開，露出子宮，zui后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。
2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30MLPBS的50ML離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉PBS，再重復此步驟一次，留少許PBS將胚胎轉移到另一裝有PBS的平皿中，用手術刀片將其細細切碎。
3.用200ul的移液槍反復快速吹打平皿中的液體，放在15ML離心管中，4℃1500rpm離心5分鐘，倒掉上清，加10ML胰酶，重懸沉淀，放37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。
4.將上層細胞懸液倒入一裝有 10MLMEF生長培養基的50ML離心管中，用200目尼龍濾網過濾后，1500rpm離心5分鐘收集細胞。30ML MEF生長培養基洗滌兩次（此步驟中作者試過用無血清的培養基洗滌，結果無差別）。
5.細胞沉淀用15ML生長培養基懸起，細胞計數（八只14天胎鼠可獲得2-3×107細胞）。
6.3×106細胞懸浮于15ML MEF生長培養基中，接種到200ML的培養瓶中。
7.24小時后更換新鮮的MEF生長培養基。
8.細胞長滿后，先用PBS沖洗，倒掉，加胰酶消化（此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘），按1：5傳代。
9.細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規凍存。（凍存液要現配）
五、討論
1.原代培養，一定要避免污染。
2. MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。
3. 凍存后復蘇的細胞只能傳代一次，因為這些細胞繁殖能力有限。
4. 消化細胞時間不要過長。
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