細胞技術專題：軟瓊脂克隆形成實驗
更新時間：2014-03-12 瀏覽次數：2500
原理：
細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續一周，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養。
基本步驟：
(1)取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用含20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至1×106細胞/L。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養10～14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數。計算形成率。
軟瓊脂培養法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。