細胞技術專題：細胞周期測定實驗
更新時間：2014-02-18 瀏覽次數：1820
標簽： 細胞周期 體外培養 周期測定
細胞周期測定可以：（1）作為生物相容性評價指標；（2）用于研究細胞凋亡；（3）作為選擇細胞的依據。
詳細
實驗方法
- 細胞計數法
- BrdU滲入法
- 流式細胞儀測定法
| 實驗方法原理 | 流式細胞儀的工作原理是將待測細胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，形成細胞柱。通過對流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測，得到該細胞的光散射和熒光指標，分析出其體積、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等物理及化學特征。
細胞內的DNA含量隨細胞周期進程發生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI標記的方法，通過流式細胞儀對細胞內DNA的相對含量進行測定，可分析細胞周期各時相的百分比。 |
|---|---|
| 實驗材料 | HeLa細胞 |
| 試劑、試劑盒 | 乙醇 RNase-A PI PBS |
| 儀器、耗材 | 流式細胞儀 細胞培養設備 離心機 水浴 冰箱 注射器 離心管 封口膜 微量移液器 |
| 實驗步驟 | 一、取對數生長期細胞，倒去培養液，胰酶適度消化細胞，用培養液吹打，800 rpm，離心 15 min去上清。
二、PBS洗2次，加0.5 mL PBS吹勻，務必吹散。
三、用5 mL注射器將細胞吸起，用力打入5 mL 70%(預冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定夜（可長至2周）。
四、800 rpm 15 min收集固定細胞，PBS洗2次。
五、用0.4 mL PBS重懸細胞并轉至Tube中輕輕吹打（防止細胞破碎）。
六、加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 μg/mL ，37℃水浴消化30 min；
七、加PI約50 μL至終濃度約為65 μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。
八、用300目（孔徑40~50微米）尼龍網過濾，上機檢測。
九、樣品分析測定及打印。 收起 |
| 其他 | 一、常見問題
A：我做過乳腺細胞的DNA含量測定，取得組織以后，先處理成單細胞懸液，然后再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的zui終濃度為50%，這樣固定的細胞懸液可以至少保存12小時，zui多可保存一個月，上機檢測前再加PI綜合染液。我就是這樣做的，保存了將近三個星期，結果還可以，變異系數為5%.
2. 實驗中想用PI分析細胞周期及凋亡率，請教幾個問題：
Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配嗎？
A：RNaseA用PBS配制沒有問題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q：（2）測細胞周期和凋亡率時都要用RNAs酶，可以一起檢測嗎？
A：用流式細胞儀測定時細胞周期和凋亡率是同時測定的，不用擔心。
Q：（3）Triton－x－100是固定劑吧，用了70％的冷乙醇（是4℃嗎？），是不是就不用Triton－x－100固定了？
A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75％的乙醇于-20度固定。
Q：（4）還要設什么內參標準（5％雞紅細胞）嗎？
A：對照肯定是需要的，這個根據自己的需要進行設置。
Q：（5）不用試劑盒行不行啊？
A：*可以不用試劑盒。
以下提供一個自己的實驗步驟供參考：
（1）200×g離心10min收集細胞；
（2）棄去上清，PBS漂洗一次，將細胞重懸于預冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上；
（3）進行流式細胞儀檢測前，200×g離心10min收集固定后的細胞；
（4）PBS洗滌一次，200×g離心10min收集細胞；
（5）將細胞重懸于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室溫孵育30min；
（6）將經PI染色和RNase A消化后的細胞懸液用300目的尼龍膜過濾后即可利用流式細胞儀進行細胞周期分布和凋亡細胞定量的分析。
3. Q：流式檢測細胞周期時加RNA酶所需的溫度？
A：其實有關RNA酶在凋亡檢測制樣過程中使用的必要性問題尚有人持不同意見，該觀點的人認為RNA酶在環境中*，常規制樣過程中所接觸的試劑和環境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA，所以為了簡便實驗操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過經典的方法還是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”。
至于染色時使用4度，是因為低溫可減弱分子運動，增強熒光染料結合的穩定性和減少可能的熒光損耗。上流式前細胞用75％乙醇固定行嗎？
4. Q：我養腫瘤細胞，測周期。看到帖子說70％乙醇必須用PBS和乙醇配，用水配細胞會碎裂，有帖子說PBS和乙醇配會出現絮狀物。上流式前細胞用75％乙醇固定，就用買來的現成的瓶裝75％乙醇，行嗎？必須那么嚴格嗎？
A：先用冷PBS懸浮細胞，大約1-2ml，充分懸浮，使細胞充分分散成單細胞。之后緩慢加入無水乙醇，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會導致細胞團聚的現象，很難重懸成單細胞。乙醇固定之后沒有細胞沉淀。
5. Q：我要做流式分析細胞周期，我大概收集了10的6次方細胞，但細胞在乙醇固定之后，還看到有細胞沉淀的，但PBS洗滌兩次之后，就基本沒什么細胞沉淀了，上機發現就發現不了細胞了。這是怎么回事啊？怎么解決這個問題啊？
A：很可能是洗細胞的過程中丟失了，解決辦法有：
（1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機
（2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時殘留1mm左右的水膜，不要吸完。
（3）離心的轉速或時間可稍微增加一點兒
（4）每次加抗體時，吸頭不要接觸液面；混勻時不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細胞。
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