生物化學技術專題：氨基轉移反應的定性鑒定
更新時間：2014-01-07 瀏覽次數：1334
一、實驗目的
（1）學習一種鑒定氨基轉移作用的簡便方法及其原理；
（2）進一步掌握紙層析的原理和操作技術；
（3）了解氨基轉移作用在中間代謝中的意義。
二、實驗原理
氨基移換酶也稱轉氨酶，它能催化α-氨基酸的氨基與α-酮酸的α-酮基互換，這種作用稱為氨基移換作用。它在生物體內蛋白質的合成與分解等中間代謝中，在糖、脂肪、蛋白質三類物質代謝的相互、相互轉化上，都起著很重要的作用。任何一種氨基酸進行轉氨作用時，都由其專一的轉氨酶催化。它們的zui適pH接近7.4。在各種轉氨酶中，以谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶（簡稱谷草轉氨酶、GOT）及谷氨酸-丙酮酸轉氨酶（簡稱谷丙轉氨酶、GPT）活力zui強。
三、試劑與器材
解剖器具、離心機、恒溫水浴、干燥箱、臺秤、層析系統等。
1/15mol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）、1%谷氨酸溶液（用KOH中和至中性）、1%丙酮酸溶液（用KOH中和至中性）、0.1%碳酸氫鉀溶液、0.05%碘乙酸溶液、15%三氯醋酸溶液、標準丙氨酸溶液（0.1%）、標準谷氨酸溶液（0.1%）、0.1%水合茚三酮乙醇溶液、酚溶劑。
四、操作方法
將兔擊暈，迅速解剖，取出肝臟，在低溫條件下剪碎。稱取勻漿后，離心取上清液，即為制備的酶液。體外氨基移換反應。紙上層析法檢查每人4個點（標準丙氨酸溶液、標準谷氨酸溶液、對照上清液、樣品上清液）。點樣放入層析罩內。用被酚所飽和的水溶液，平衡后，用帶小漏斗的玻璃管從層析罩上加飽合酚試劑25ml于層析缸內。然后，立即蓋緊塞子，當溶劑前沿達到距濾紙上端約2.5cm處，取出濾紙，晾干或吹干，以除去酚溶劑，噴灑0.1%茚三酮乙醇溶液，放入烘箱中顯色氨基酸與茚三酮反應，在濾紙上呈現紫紅色斑點。
五、關鍵步驟與注意事項
①取動物新鮮組織制備酶液，防止酶失活。
② 加碘乙酸抑制酶解作用。
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