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蛋白質(zhì)技術(shù)專題：TNF-α生物學(xué)活性檢測方法
更新時間：2013-12-11 瀏覽次數(shù)：1789
基本原理
TNF的生物學(xué)活性之一是能直接殺傷腫瘤細(xì)胞。TNF與相應(yīng)受體結(jié)合后向細(xì)胞內(nèi)移，被靶細(xì)胞溶酶體攝取導(dǎo)致溶酶體穩(wěn)定性降低，各種酶外泄，引起細(xì)胞溶解。腫瘤細(xì)胞株對TNF-α的敏感性有很大的差異，用放線菌素D、絲裂酶素C、放線菌酮等處理腫瘤細(xì)胞，可明顯增強(qiáng)TNF-α殺傷腫瘤細(xì)胞活性。
材料和試劑
1，*培養(yǎng)基（1）10%FCS-DMEM培養(yǎng)液（V/V）。
2，*培養(yǎng)基（2）3%FCS-DMEM培養(yǎng)液（V/V）0.5-1μg/ml放線菌素-D。
3，0.05%結(jié)晶紫溶液：
取50mg結(jié)晶紫，用20ml無水乙醇溶解后，加水定容至100ml，室溫保存。
4，脫色液：
H2O 50mg
無水乙醇 50ml
乙酸 0.1ml
混勻即可。
5，TNF標(biāo)準(zhǔn)品：由中國藥品生物制品檢定所提供。
實(shí)驗(yàn)操作
1，此實(shí)驗(yàn)在無菌環(huán)境下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前超凈工作臺應(yīng)用紫外燈照射30分鐘以上。
2，用*培養(yǎng)基（1）將生長狀態(tài)良好的小鼠L929細(xì)胞調(diào)至1×105/ml的細(xì)胞懸液，100μg/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5%CO2，37℃培養(yǎng)過。
3，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用*培養(yǎng)基（2）將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍稀釋至100IU/ml為起始濃度，再做4倍稀釋上板。
4，待檢樣品稀釋：用*培養(yǎng)基（2）將待檢樣品進(jìn)行10倍稀釋至一定范圍，再做4倍稀釋準(zhǔn)備上板。
5，棄96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上清，將標(biāo)準(zhǔn)品及待檢樣品按100μl/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時設(shè)對照組和空白組，5%CO2，37℃培養(yǎng)16小時。
6，鏡檢后，棄上清，每孔加30μl 0.05%結(jié)晶紫染色3~5分鐘，用流水小心沖去結(jié)晶紫，甩干培養(yǎng)孔中的殘余水份，加入脫色液100μl/孔，用酶標(biāo)儀測定570nm的光密度值。
結(jié)果計算
1，在座標(biāo)紙上以O(shè)D570比色值（雙孔比色值的平均值）對稀釋倍數(shù)作圖，以標(biāo)準(zhǔn)品的zui紙、zui高平均值作平等于X軸的直線，以各相應(yīng)樣品曲線與該直線的交點(diǎn)，在X軸讀出半效量的稀釋度。
2，計算公式：
TNF活性（IU/ml）=標(biāo)準(zhǔn)品效價×樣品預(yù)稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)×標(biāo)準(zhǔn)品半效量稀釋度/樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋度。