感受態專題：電轉化流程
更新時間：2013-11-06 瀏覽次數：1253
一、電轉化感受態細胞的制備
1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養基的50ml離心管中。（同時做培養基和槍頭的空白對照）
2.37℃，220rpm，培養14-16個小時。
3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養基中，37度，220rpm，振搖2-3小時，每半小時測一次OD，當OD值達到0.3-0.4時，停止培養。
4.將菌液在冰上預冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml 預冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10分鐘。
5.棄上清，離心杯中加入少量ddH2O，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4℃，4000rpm離心10分鐘。
6.棄上清，加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿離心杯，4000rpm，4℃，離心10min。
7.棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油（滅菌，預冷），重懸菌體，再加滿10%甘油, 4℃, 4000rpm, 離心10min。
8.棄上清，每個離心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液以300ul/管分裝于1.5ml的離心管中，-80 ℃冰箱中保存。同時取100 μl感受態加0.01ng puc18直接電穿孔轉化，檢測轉化效率。
9. 次日觀察轉化子生長情況，并記錄。
二、連接產物純化
1．將連接產物轉移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列試劑:
10μl of ddH2O
2μl of 3M NaAC（PH5.2）
50μl of 無水乙醇
輕輕混勻，稍微離心并將其置于-20℃放置1小時以上；
2.4℃，top Speed 離心30分鐘；
3.小心移去上清，避免接觸到管底的沉淀物；
4.加入500μl70%的乙醇，輕輕顛倒幾次洗滌沉淀（注：不要離心混勻）；
5.4℃，top Speed離心5分鐘；
6.小心移去上清，將此Eppendorf管置空氣中直至無乙醇氣味；
7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃長期保存備用；
三、電轉化
1.從-80℃冰箱中取出感受態細胞，置于冰上解凍；
2.取1 μl 純化后的質粒于一1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預冷。
3.將40～100ul解凍的感受態細胞轉移至此1.5ml 的離心管中，小心混勻，冰上放置10min。
4.打開電轉儀，調至Manual，調節電壓為2.1KV。
5.將此混合物轉移至已預冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進入電極杯的底部；
6.將電極杯推入電轉化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1000μl的SOC液體培養基，重懸細胞后，轉移到1.5ml的離心管中。
7．37℃，220－250rpm復蘇1小時。
8. 取20μl轉化產物加160μlSOC涂板，放于37℃溫室，過培養，次日查看轉化結果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混勻－80℃保存。
注：每塊加有Amp的平板上均勻涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。
四、電擊杯清洗流程
1.用清水將電擊杯稍沖一下。
2.向電擊杯中加入的75%酒精浸泡2hr。
3.棄去酒精，再用蒸餾水沖洗2~3遍，然后用1ml的槍吸取超純水反復吹打電擊杯10遍以上。
4.加入無水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30分鐘。
5.棄去無水乙醇，于通風廚內揮干乙醇。
6.將清洗好的電擊杯放入-20 ℃冰箱內待用。
注：1．不同樣品使用的電機杯應分開；
2．每周用1%酒精浸泡30分鐘。
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