細(xì)胞轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)方法
更新時(shí)間：2013-10-30 瀏覽次數(shù)：1154
實(shí)驗(yàn)原理
脂質(zhì) 體（LR）試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它適用于把DNA 轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下zui方面的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。
用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做。先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1-5ug和孵育時(shí)間6h，開(kāi)始，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者*的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間。因LR對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過(guò)24h為宜。
細(xì)胞種類(lèi)：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 操作步驟（方法一）：
1） 取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2ml含（1-2） x 105 個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基，37℃、18% CO2 培養(yǎng)基40%-60%匯合時(shí)。
2） 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液（為轉(zhuǎn)染1個(gè)空細(xì)胞所用的量）。
A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug，終量100ul。
B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR，使終濃度為2-50ug，終量100ul。
輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染。
3） 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2ml不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1ml不含血清培養(yǎng)基。
4） 轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h，吸除無(wú)血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
5） 其余處理：如觀察、篩選、檢測(cè)等與其他轉(zhuǎn)染法相同。
6） 注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大影響。
2. 快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟（方法二）：
1） 將細(xì)胞以5 x 105個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h，使其達(dá)到50%-60%板底面積。
2） 在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。
a. 在1ml無(wú)血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。
b. 旋轉(zhuǎn)1s，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。
c. 室溫下放置5-10min，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。
3） 棄去細(xì)胞中的舊液，用1ml無(wú)血清DMEM洗細(xì)胞1次后棄去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3-5天。
4） 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。
5） 吸出DMEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培養(yǎng)24-48h。
6） 用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。
3. 穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：
1） 接種細(xì)胞同前述，細(xì)胞長(zhǎng)至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。
2） DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前。
3） 在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培養(yǎng)48h。
4） 吸出DMEM，用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng) 一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行。
4. Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉(zhuǎn)染單層貼壁細(xì)胞。（別的方法可以參考生產(chǎn)商提供的protocol）
1） 轉(zhuǎn)染前1天將0.5～2×105細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含抗生素 的*培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90～95％。
2） 準(zhǔn)備復(fù)合物
a. 將0.8ug DNA稀釋于50ul無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。
b. 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意：必須在25分內(nèi)進(jìn)行。
c. 5分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。
3） 吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS或無(wú)血清培養(yǎng)基（）清洗細(xì)胞2次。
4） 將復(fù)合物（總體積100ul）加入培養(yǎng)孔，前后搖動(dòng)培養(yǎng)板使其分布均勻。
5） 將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱 孵育4～6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復(fù)合物（也可不用）。
6） 24～48h后可以觀察轉(zhuǎn)入基因表達(dá) 情況。
7） 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：換含血清培養(yǎng)基24h后將細(xì)胞以1：10（或更高比例）傳代，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。
8） 優(yōu)化：要保證細(xì)胞匯合率達(dá)90～95％（比較高）；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般細(xì)胞1：2～3。