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RNA實驗技術：核糖核酸酶保護分析
更新時間：2013-10-22 瀏覽次數：1291
一、體外轉錄
在無菌1.5 ml 微型離心管中，結合以下內容：
4 ul 5倍轉錄緩沖液
2 ul 0.1 M DTT
4 ul 2.5 MM NTP（A，C，G）
0.8 ul RNA酶抑制劑（25 U/ul）RNA酶抑制劑（Promega）中
100 UM冷UTP
100 UM冷UTP
1 ul/ug UL線性DNA模板
5 ul 10 UCI / UL P32 UTP（800Ci/mmol）
1 ul RNA聚合酶SP6，T7或T3
總體積?20 ul。
孵育1小時，37℃。
2 ul 每個轉錄的DNA酶I，孵育20分鐘， 37℃。
二、探頭凈化
凈化探頭使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除試劑盒或Boehringer離心柱（G50葡聚糖凝膠）。檢查1 ul 在閃爍計數器，P32通道。一個很好的探頭將5×105~1×106 CPM。
三、雜交
打開heatblock到95C。對于在水或乙醇中的樣品，干燥適當的RNA量，并包括一個管與1 ul tRNA或糖原（Sigma公司），這是作為陰性對照。
每個樣品應具有以下：
24 ul 甲酰胺
2 ul 0.6 M管
2.4 ul 5 M氯化鈉
0.3 ul 0.1 M EDTA
2×105 cpm探針
5×104 cpm加載控制探針
DEPC水
DEPC水
總體積30ul
以及混合樣品。加熱95℃，10分鐘。孵育4小時， 55°C。
四、RNase消化
核糖核酸酶消化緩沖液：
300 MM 醋酸鈉
10 mM 的TRIS
5 mM EDTA
每個樣品添加350 ul 消化緩沖液。
1 ul 4 mg/ml 核糖核酸酶A和0.4 ul 10 u/ul 核糖核酸酶T1。
孵育，30℃，45分鐘至1小時。
五、蛋白酶K
向每個樣品中添加20%SDS和2.5 ul 的10 mg/ml 的蛋白酶K孵育，37℃ 10 μl 的15-20分鐘。
六：清理
提取一次400 ul 酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）
將上清轉移到新的試管中。加入1000 ul 的100%乙醇和1 μl 為10 mg/ml 的糖原。拌勻。
在-70℃，30分鐘或在干冰/ ETOH浴中10分鐘孵育樣品。
旋轉的離心15分鐘。吸EtOH。讓小球在空氣中晾干。
重懸在8 ul 甲酰胺的裝載染料。允許坐在RT 5-10分鐘，經常攪拌。
七：聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
熱樣品5分鐘，100℃。加載到5%polyacrylamide/7 M尿素變性凝膠2000 cpm 的分子量標記物。運行凝膠38-42mA。干凝膠，暴露于膜O / N在-70C增感屏。