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RNA實驗技術：Northern blot實驗
更新時間：2013-10-22 瀏覽次數：1624
Northern blot 是一種通過檢測RNA的表達水平來檢測基因表達的方法，通過northernblot的方法可以檢測到細胞在生長發育特定階段或者脅迫或病理環境下特定基因表達情況。Northern blot 首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據其分子量大小加以區分，然后通過與特定基因互補配對的探針雜交來檢測目的片段。
實驗方法
- Northern blot技術
- Northern Blot
| 實驗方法原理 | Northern blot的基本概述是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉移至尼龍膜等固相膜載體上，用放射性或非放射性標記DNA或RNA特異性探針對固定于固相膜上的mRNA進行雜交，洗膜去除非特異性結合雜交信號，經放射自顯影或現色反應，對雜交信號進行分析。將雜交的mRNA分子在電泳中遷移位置與標準分子量分子進行比較，即可知道細胞中特定的基因轉錄產物的大小；對雜交信號的強弱比較，可以知曉該基因表達mRNA水平的強弱。 |
|---|---|
| 實驗材料 | DNA |
| 試劑、試劑盒 | MOPS電泳buffer 甲醛凝膠加樣buffer EB EGFR探針 DIG SSC |
| 儀器、耗材 | 水平電泳儀 制冰機 恒溫水浴箱 凝膠成像系統 EP管 移液器 Tip頭 |
| 實驗步驟 | 一、RNA轉移與固定 1. 變性瓊脂糖電泳分離總RNA樣品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝膠片刻，10×SSC中浸泡平衡凝膠30 min。 2. 按southern blot實驗中DNA轉移方法及裝置轉移總RNA至尼龍膜上（過程中注意無RNA酶操作）。 3. 1×SSC淋洗尼龍膜后濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙中80℃烤箱烘烤2小時。 4. RNA染色，干燥的尼龍膜先于5%冰乙酸中室溫浸泡15 min。 5. 于0.5 mol/L 乙酸鈉和0.04%亞甲藍溶液中浸泡5~10 min。 6. 去離子水淋洗膜5~10 min，可見RNA標準及28s及18 sRNA的條帶，軟鉛筆標記。 二、預雜交、雜交及顯色 1. Washing buffer潤洗1遍（3~5 min）。 2. 100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。 3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。 4. Washing buffer洗膜（15 min×2）。 5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。 6. 將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數min至1天（出現顏色時不要搖動）。 7. 當出現條帶時，TE-buffer洗膜（5 min×1），終止現色。 8. 照相記錄，80℃烤干，儲存。 9. 掃描計算EGFR基因擴增的倍數。 |
| 注意事項 | 1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。 2. 凝膠中不要加入EB，以免降低雜交的效率。 3. 為降低膜雜交本底，可適當延長預雜交時間。 |