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RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：RNAi表達(dá)載體構(gòu)建
更新時(shí)間：2013-10-12 瀏覽次數(shù)：1489
近年來的研究表明,一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá),誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型, 稱為RNA干擾（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子,能夠以序列同源互補(bǔ)的mRNA為靶目標(biāo),降解特定的mRNA.RNAi的發(fā)現(xiàn)具有劃時(shí)代的意義,它不僅深入揭示 了細(xì)胞內(nèi)基因沉默的機(jī)制,而且它還是后基因組時(shí)代基因功能分析的有力工具,極大地促進(jìn)了人類揭示生命奧秘的進(jìn)程.現(xiàn)在越來越多的研究人員開始采用RNAi 來研究生物體的基因表達(dá).RNAi技術(shù)可廣泛應(yīng)用到包括功能基因組學(xué),藥物靶點(diǎn)篩選,細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路分析,疾病治療等等.
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括：
·化學(xué)合成
·體外轉(zhuǎn)錄
·長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 （e.g. Dicer, E. coli, RNase III）
·siRNA表達(dá)載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs
·PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)
獲得高純度的siRNA產(chǎn)物是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的*步,而轉(zhuǎn)染的效率則是非常關(guān)鍵的因素.
一、基本概念
RNAi：（RNA interference）RNA干擾
內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的特異基因表達(dá)沉默或抑制的效應(yīng),誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾,它也是體內(nèi)抵御外在感染的一種重要保護(hù)機(jī)制.
siRNA ：（small interfering RNAs）小干擾RNA
由長dsRNA裂解而成的一種19-25nt的短片斷雙鏈RNA分子,能夠以同源互補(bǔ)序列的RNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA, RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子.
shRNAs:（small hairpin RNA ）小發(fā)夾RNA
是設(shè)計(jì)為能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小RNA分子,shRNA需通過載體導(dǎo)入細(xì)胞后,然后利用細(xì)胞內(nèi)的酶切機(jī)制得到siRNA而zui終發(fā)揮RNA干擾作用.
Dicer：屬于RNaseⅢ 家族,是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶
RISC：（RNA-inducing silencing complex） RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體,具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性
二、機(jī)制
目前普遍認(rèn)為,共抑制、基因壓制和RNAi很可能具有相同的分子機(jī)制,都是通過dsRNA的介導(dǎo)而特異地降解靶mRNA, 抑制相應(yīng)基因的表達(dá). 即RNAi、共抑制、quelling均屬于PTGS！現(xiàn)已初步闡明dsRNA介導(dǎo)的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步.
*步（起始階段）是較長ds RNA在ATP參與下被RNaseⅢ樣的特異核酸酶切割加工成21~23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）.
第二步（效應(yīng)階段）是siRNA 在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈,并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex,RISC）.
RNAi途徑主要存在于細(xì)胞漿中,但是siRNA產(chǎn)生、靶mRNA降解的亞細(xì)胞位置尚未明確.外源性（注射或喂養(yǎng)）的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接進(jìn)入細(xì)胞漿中的RNAi途徑,僅在細(xì)胞漿中復(fù)制的RNA病毒可被dsRNA介導(dǎo)的沉默機(jī)制所抑制.外源性dsRNA則還可導(dǎo)致細(xì)胞核中的同源早期 RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物減少.
在許多機(jī)體中反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因序列在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成發(fā)夾dsRNA,進(jìn)而可介導(dǎo)RNAi,這種dsRNA可能需要轉(zhuǎn)移至胞漿中才可有效地沉默同源靶mRNA.
RNAi的放大效應(yīng)機(jī)制
siRNA不僅可引導(dǎo)RISC切割靶RNA,而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA.
新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNaseⅢ樣核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA.次級siRNA又可進(jìn)入合成-切割的循環(huán)過程,進(jìn)一步放大RNAi作用.這種合成-切割的循環(huán)過程稱為隨機(jī)降解性PCR（random degradative PCR）.
三、RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建
1. 目的基因的確定
（1）、檢索文獻(xiàn)獲取有實(shí)驗(yàn)證明有效的靶點(diǎn)序列（核對）
（2）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
（3）、http://www.google.cn/ or http://scholar.google.com
2、設(shè)計(jì)siRNA靶序列
在制備siRNA 前都需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列.研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動(dòng)物細(xì)胞,zui有效的siRNAs是21-23個(gè)堿基大小、3’端有兩個(gè)突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動(dòng)物,比較有效的是長片段dsRNA.siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn),與靶mRNA之間一個(gè)堿基錯(cuò)配都會(huì)顯著削弱基因沉默的效果.
（1）、選擇siRNA靶位點(diǎn)：
從轉(zhuǎn)錄AUG起始密碼子開始,搜尋下游AA序列,記錄跟每個(gè)AA 3’端相鄰的19個(gè)核苷酸作為候選的siRNA靶位點(diǎn).有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效. Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions,UTRs）,原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域,而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié) 合mRNA從而影響siRNA的效果.
（2）、序列同源性分析:
將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人,或者小鼠,大鼠等等）進(jìn)行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列.例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚,可能是位置效應(yīng)的結(jié)果,因此對于一個(gè)目的基因,一般要選擇3-5個(gè)靶位點(diǎn)來設(shè)計(jì)siRNA.
通常來說,每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3—4對siRNAs,選擇zui有效的進(jìn)行后續(xù)研究. （3）、設(shè)計(jì)陰性對照：
一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對照,作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成,但是和mRNA沒有明顯的同源性.通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂.當(dāng)然,同樣要保證它和其他基因沒有同源性.
3、RNAi表達(dá)載體的選用
化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點(diǎn)：siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解；進(jìn)入細(xì)胞siRNA在細(xì)胞內(nèi)的 RNAi效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短.針對這種情況,出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達(dá).該方法的基本思路是：將siRNA對應(yīng)的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動(dòng)子后,這樣就能在體內(nèi)表達(dá)所需的siRNA分子.這種方法總體的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA,能達(dá)到較長時(shí)間的基因沉默效果.
通過質(zhì)粒表達(dá)siRNAs大都是用Pol III啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼shRNA（small hairpin RNA）的序列.選用Pol III啟動(dòng)子的原因在于這個(gè)啟動(dòng)子總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA,遇到4—5個(gè)連續(xù)的U即終止,非常.當(dāng)這種帶有Pol III 啟動(dòng)子和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí),這種能表達(dá)siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá),可抑制外源基因和內(nèi)源基因.采用質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于,通過siRNA表達(dá)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記,siRNA載體能夠更長時(shí)間地抑制目的基因表達(dá).當(dāng)然還有一點(diǎn),那就是由于質(zhì)粒可以復(fù)制擴(kuò)增,相比起其它合成方法來說,這就能夠顯著降低制備siRNA的成本.
此外,帶有抗生素標(biāo)記的siRNA表達(dá)載體可用于長期抑制研究,通過抗性輔助篩選,該質(zhì)粒可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)數(shù)星期甚至更久.同時(shí)RNAi-Ready表達(dá)載體還能與逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒表達(dá)系統(tǒng)整合（BD Knockout RNAi Systems）,大大提高siRNA表達(dá)載體對宿主細(xì)胞的侵染性,*克服某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的障礙,是實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNAs瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表 達(dá)的理想工具.
4、合成模板
合成編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈,模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn),同時(shí)兩端分別設(shè)計(jì) BamH I 和 Hind III 酶切位點(diǎn),可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點(diǎn)的 BamH I 和 Hind III 酶切位點(diǎn)之間.
95℃,5min,緩慢退火, DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板
5、連接與轉(zhuǎn)化
基本步驟：
（1）將100μl感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍.
（2）取5μl連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以 混勻內(nèi)容物. 在冰上放置30分鐘.
（3）將管放入預(yù)加溫到42℃的水浴中,熱激90秒.快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻1~2分鐘.
（4）每管中加700μl LB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí),進(jìn)行復(fù)蘇.
（5）室溫4,000rpm離心5分鐘,棄去上清后,用剩余100μl培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面.注意：細(xì)胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細(xì)胞的效率進(jìn)行調(diào)整.
（6）將平板置于室溫直至液體被吸收.
（7）倒置平皿,于37℃培養(yǎng),12~16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落.
6、PCR鑒定和測序鑒定
在插入編碼shRNA的DNA雙鏈模板兩側(cè)設(shè)計(jì)鑒定PCR引物,擴(kuò)增片段在100-200bp之間.
7、特點(diǎn)
siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于這是眾多方法中*可以進(jìn)行長期研究的方法——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá),持續(xù)數(shù)星期甚至更久.即使是對轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)篩選,也有助于富集帶質(zhì)粒的細(xì)胞.這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問題.
載體上的抗性標(biāo)記有助于快速篩選出陽性克隆,而且可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá),持續(xù)數(shù)星期甚至更久,可以進(jìn)行較長期研究 .
四、RNAi的前景展望
1、研究基因功能的新工具
已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中滅活或降低特異性基因的表達(dá),制作多種表型,而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段,產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng).線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢,發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因,RNAi將大大促進(jìn)對這些新基因功能的研究.與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比,這一技術(shù)具有投入少,周期短,操作簡單等優(yōu)勢,近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多,標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能*的工具.
2、研究信號傳導(dǎo)通路的新途徑
聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系,Clemensy等應(yīng)用RNAi研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑,取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路*一致的結(jié)果,在此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1與DACK之間的關(guān)系, 證實(shí)了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡單、快速、重復(fù)性好,克服了轉(zhuǎn)
染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn), 因此認(rèn)為RNAi技術(shù)將可能成為研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的新途徑.
3、開展基因治療的新策略
RNAi具有抵抗病毒入侵,抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng),防止自私基因序列過量增殖等作用,因此可以利用RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動(dòng)物,并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的dsRNA抵抗多種病毒.
腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果,傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能*抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長, 而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性, 設(shè)計(jì)針對這一區(qū)段序列的dsRNA分子,只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn),也可以同時(shí)注射多種dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除.
盡管目前RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用還處于探索階段,但它在斑馬魚和老鼠等脊椎動(dòng)物中的成功應(yīng)用預(yù)示著RNAi將成為基因治療中重要的組成部分,人工合成的dsRNA寡聚藥物的開發(fā)將可能成為發(fā)展前途的新興產(chǎn)業(yè).