RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：總RNA的提取
更新時(shí)間：2013-10-12 瀏覽次數(shù)：1896
完整RNA 的提取和純化，是進(jìn)行RNA 方面的研究工作，如Nothern雜交、mRNA 分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即１）：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；２），有效地使核蛋白復(fù)合體變性；３），對(duì)內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5），對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中zui關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑，1），提取總核酸，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來；2），直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA 留在水相。*種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA 的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。
方法一:總RNA 的試劑盒快速提取
一些公司推出的總RNA 提取試劑盒，可以用來制備高質(zhì)量的可用于建庫(kù)的RNA 。該總RNA 純化系統(tǒng)采用兩種的RNA 酶抑制劑，異硫氰酸弧（GTC）和β-巰基乙醇，加上整個(gè)操作都在冰浴下進(jìn)行，這樣就能顯著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復(fù)合體的解離，使RNA 與蛋白質(zhì)分離，并將RNA 釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化RNA ，則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA 進(jìn)入水相，這樣使其與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA 可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA 沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，而RNA 中如含無機(jī)鹽，則有可能對(duì)以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。
一：儀器
恒溫水浴，冷凍高速離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)，取液器，電泳儀，電泳槽。
二：試劑
RNA 提取試劑盒，0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC），75%乙醇
操作步驟
（一）:細(xì)胞或組織破碎
A:微生物材料
１：發(fā)酵３－４天（或?qū)?shù)生長(zhǎng)期）的菌體，離心收集菌絲體（動(dòng)植物材料無需此步處理）
２：用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體２－３次，并盡量除去殘存的水
３：加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA
４：研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至１２ml變性液的容器中勻漿。
B:動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)材料 （適用的樣品量為細(xì)胞:108）
1:細(xì)胞或組織培養(yǎng):按常規(guī)方法進(jìn)行
2:深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎:
（1）細(xì)胞收集:含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中，4℃，3000g離心5分鐘
（2）細(xì)胞洗滌:上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌，然后4℃，3000g離心5分鐘，
（3）細(xì)胞破碎:在沉淀細(xì)胞中加入15毫升預(yù)冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿
3:表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎:
（1）確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)108
（2）細(xì)胞收集:將培養(yǎng)液倒掉，用預(yù)冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養(yǎng)瓶中加入8毫升預(yù)冷變性液，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞溶解，此時(shí)可見粘度加大。
（3）用無菌吸管將*個(gè)培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個(gè)培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)，溶解細(xì)胞，再吸入第三個(gè)培養(yǎng)瓶，以此類推，直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次，然后從*個(gè)培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液，將所有培養(yǎng)瓶洗一次。
（4）將上述12毫升含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50毫升無菌離心管中，勻漿破碎細(xì)胞。
C:植物組織破碎 （適用的樣品量為0.05g組織）
（1）將600ul變性液置于1.5ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）將0.05g新鮮組織用液氮冰凍
（3）在液氮下，研磨組織塊
（4）待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。
D:動(dòng)物組織破碎 （適用的樣品量為1克組織）
（1）將12毫升變性液置于50毫升離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）在上述管中加入1克新鮮或冰凍動(dòng)物組織，勻漿粉碎。
注1:研磨組織塊用于RNA 提取的樣品，必須是新鮮的細(xì)胞或組織，如采樣后，不能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。
2:變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷。
（二）:RNA 的抽提
在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸鈉*混勻，可用漩渦振蕩器。
600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），*混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
冰裕中10-15分鐘，離心，4℃，10000g，20分鐘。
上層水相吸至無菌離心管中+等體積的異丙醇，-70℃，30分鐘沉淀RNA。
離心4℃，10000g，20分鐘。
沉淀RNA ，冷凍干燥15分鐘 ， RNA 沉淀重新溶于300ul變性液中，可振蕩（有時(shí)為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時(shí)間應(yīng)極短）。
60ulpH4.0的2M乙酸鈉*混勻，可用漩渦振蕩器。
600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），*混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
冰裕中10-15分鐘，離心，4℃，10000g，20分鐘。
上層水相吸至無菌離心管中。
等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30分鐘），７５％乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥，復(fù)溶于去RNA 酶的水中（對(duì)于準(zhǔn)備長(zhǎng)期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25M，再加入2.5體積的乙醇，－７０℃保存。）
注：1變性液組成：25g異硫氰酸胍溶于33mlCSB（42mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2mM β-巰基乙醇），65℃溶解，過濾滅菌，4℃預(yù)冷。
2酸性酚配制：55℃時(shí)，500g酚溶入500ml50mM，pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復(fù)加500ml50mM，pH4.0乙酸鈉，直到pH<4.1。
方法二: 氯化鋰法提取總RNA
本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA 酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA ，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA ，具有快速簡(jiǎn)潔的長(zhǎng)處，但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高，小RNA 片斷丟失的缺陷。
儀器： 同上
試劑：
氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g（3M） 尿素、360g（6M） 加水至1L，過濾滅菌】
懸浮液【10mM Tris-HCL （pH7.6） ，1mM EDTA （pH8，0） ，0.5%SDS】
其余同上
操作步驟：
1：對(duì)于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對(duì)于少量細(xì)胞（107個(gè)細(xì)胞/ml），則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中
2：勻槳液在0－4℃放置4小時(shí)后，12000g離心30分鐘
3：取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復(fù)步驟2
4：沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻，4000g離心5分鐘
5：取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時(shí)，5000g離心。
6：70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
7：RNA 溶解液溶解沉淀，得RNA ，分裝，于－70℃保存。