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【DNA原位雜交技術】 熒光原位雜交（FISH）探針的制備及其應用
更新時間：2013-09-04 瀏覽次數：5852
zui近有一些戰友對熒光原位雜交技術比較感興趣，我整理了相關資料和自己的心得，和大家交流一下。不妥之處，請大家指出，共同討論學習。
內容分三部分：
一、概述
1. 克隆性染色體異常是腫瘤的特征
2. 染色體異常常見的類型
3. 染色體異常的檢測方法
二、熒光原位雜交及其探針
1. 熒光原位雜交的原理
2. 熒光原位雜交的探針
三、熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交（按試驗流程介紹）
一、 概述
1. 克隆性染色體異常是腫瘤的特征
1914年德國遺傳學家Boveri就提出染色體畸變與腫瘤起源相關，然而這還僅僅只是一個假說；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的患者中發現后來被稱為費城染色體（Philadelphia chromosome）的微小染色體；1973年Rowley證實了Ph染色體是9號和22號染色體易位所致，這是人們在腫瘤中認識到的*個染色體易位；目前，已經有11,500篇文獻報道了55,600多種克隆性細胞遺傳學異常。這些染色體畸變，尤其是染色體易位及其相應的融合基因在腫瘤致病的起始階段有著重要的作用，無不說明克隆性細胞遺傳學異常是腫瘤的特征，在腫瘤起源中起重要作用。
下圖是各種疾病報告的克隆性染色體異常病例數
下圖是染色體數目異常
染色體結構異常
3. 染色體異常的檢測方法
下圖是各種疾病報告的克隆性染色體異常病例數
2. 染色體異常的常見類型
染色體異常指數目異常和結構異常兩類：前者包括整條染色體數目的擴增和缺失；后者包括染色體易位、插入、倒置、區帶的缺失或擴增等。
下圖是染色體數目異常
染色體結構異常
3. 染色體異常的檢測方法
染色體異常的識別得益于二十世紀六十年代后發展起來的胰蛋白酶－姬姆薩染色和常規顯帶技術，使得常規篩查全基因組染色體異常和檢測染色體核型改變成為可能。染色體顯帶是細胞遺傳學分析技術中標準和常用的方法，但耗時且依賴于獲得良好的分裂相，還難于分析復雜和隱匿的異常。
二、 熒光原位雜交及其探針
1. 熒光原位雜交的原理
染色體熒光原位雜交始于傳統的細胞遺傳學和DNA技術的結合，這種結合開創了一門新的學科——分子細胞遺傳學。其基礎是Southern blot原理，以半抗原如生物素、地高辛間接標記或以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩定的異源雙鏈DNA，通過熒光標記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。FISH具有快速靈敏、特異性好的特點，可同時分析分裂期和間期的多個細胞，并進行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變以及復雜核型；還可以使用多種熒光標記，顯示DNA段及基因之間的相對位置與方向，空間定位。
2. 熒光原位雜交探針的類型
FISH技術種類甚多，發展迅速，其實現需要獲得能與靶序列互補結合的探針。常用的探針有以下三類：
（1）染色體重復序列探針，主要是指著絲粒α-衛星 DNA重復序列探針和端粒重復序列探針，用以檢測染色體數目異常，同時由于G顯帶時，端粒區是蒼白的，因此涉及此區的易位常難以檢測，而應用端粒探針則彌補了G顯帶的不足；
（2）染色體涂染探針，包括通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區帶的涂染探針，用以檢測染色體數目或結構異常；
（3）染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體（yeast artificial chromosome, YAC）、細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC）、P1人工染色體（P1 artificial chromosome, PAC）探針，主要用以識別染色體的易位、缺失和擴增。
（1）染色體重復序列探針，主要是指著絲粒α-衛星 DNA重復序列探針和端粒重復序列探針，用以檢測染色體數目異常，同時由于G顯帶時，端粒區是蒼白的，因此涉及此區的易位常難以檢測，而應用端粒探針則彌補了G顯帶的不足；
（2）染色體涂染探針，包括通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區帶的涂染探針，用以檢測染色體數目或結構異常；
（3）染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體（yeast artificial chromosome, YAC）、細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC）、P1人工染色體（P1 artificial chromosome, PAC）探針，主要用以識別染色體的易位、缺失和擴增。
α-衛星DNA（alpha salite DNA）是*一個存在于所有人類染色體著絲粒區域的著絲粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位組成的高度串聯重復片段，重復數百次至數千次，跨越長達100kb的著絲粒DNA區域，其雜交將產生很強的雜交信號。因此常被選為著絲粒探針的來源。
The Wellcome Trust Sanger Institute（Hinxton, Cambridge）由Wellcome Trust和British Medical Research Council聯合建立，是世界上較早開展人類基因組大規模測序并具有相當實力的測序中心。該中心利用能容納大片段人類基因組DNA的高容量載體（如粘粒、BAC、PAC等）構建了大片段人類基因組DNA文庫，通過文庫中末端相互重疊的DNA段連接成疊連群（contig）并與鳥槍法相結合，加快了基因組測序，實現了人類基因組計劃（Human Genome Project，HGP）中人類基因組的物理作圖（physical mapping）和基因組測序相結合的目標。因此，這些克隆文庫為基因定位研究提供了豐富的DNA 序列資源，NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics提供的網絡生物信息學資源也記載了許多克隆基因組定位的詳細信息，為我們選擇相應克隆為作為染色體單一序列和端粒探針的來源提供了便利。
大片段人類基因組DNA文庫的構建過程
常用的BAC、PAC文庫
三、 熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交
實驗流程
*天
缺口平移標記探針
1.1 試劑準備
（1） 0.1 mmol/L dNTP 0.3 mmol/L dATP、0.3 mmol/L dCTP和0.3 mmol/L dGTP等體積混合。
（2） 0.1mmol/L dTTP 1倍體積的0.3mmol/L dTTP和2倍體積的三蒸水混合。
1.2 缺口平移體系和反應條件
0.1mmol/L dTTP 6.5μl
0.1mmol/L dNTP 10μl
10× Nick Translation buffer 5μl
1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl
Nick Translation Enzyme 10μl
DNA （1μg） X μl
H2O 18-X μl
in total 50μl
以上為標記1μg DNA的缺口平移體系，若標記更多量的DNA，則試劑量和反應體系相應等倍擴大。各成分混勻后短時離心。對于≤10kb的質粒，于15 ℃ 反應3.5小時；對于BAC/PAC，于15 ℃ 反應9小時。
1.3 凝膠電泳判斷探針大小
將EP管置于冰上，取其中5 μl 于70 ℃加熱5分鐘后行2 ％瓊脂糖凝膠電泳以觀察所標記探針的大小，單一序列探針合適大小為200～600 bp；如片段大小偏大，則于15℃延長反應10～30分鐘，再重復進行凝膠電泳，直至得到合適大小的探針。
1.4 終止反應
向反應體系中加入1 μl 0.5 M EDTA和（或）70 ℃加熱5分鐘，以滅活酶。探針于-20 ℃保存備用。
1.2 DNA的沉淀
1.3 清洗沉淀
注：當大部分乙醇蒸發時，白色的DNA沉淀變為半透明狀；一定要*清除乙醇，否則會在加入Master Mix后產生微小的沉淀，導致高背景。
1.4 溶解探針
2. 標本（染色體靶DNA）的處理和變性
2.2 RNase A消化
2.3 靶DNA的變性
2.4 蛋白酶消化
3. 雜交
1.2 滴加一抗
1.3 滴加二抗
1.4 滴加三抗
2. 核復染和抗熒光淬滅劑封片
3. 熒光顯微鏡檢測FISH雜交信號
第二天
1. 探針的沉淀和變性
1.1 探針混合物的組成
（1） 對BAC/PAC探針
DNA探針 5ul
Human Cot-1 DNA 3ul
Salmon Sperm DNA 0.5ul
H2O 1.5ul
in total 10ul
（2） 對著絲粒探針：
DNA探針 5ul
Salmon Sperm DNA 0.5ul
H2O 4.5ul
in total 10ul
1.2 DNA的沉淀
將探針混合物與1ul（V/10）3M 醋酸鈉（PH5.2）和27.5ul（2.5V）無水乙醇（-20℃凍存）混合，-80℃沉淀30min（或-20℃沉淀），以14000g在4℃離心30min，以沉淀DNA。
1.3 清洗沉淀
小心棄去上清，用70 ％乙醇洗滌一次，再次以14000g在4℃離心15min；小心棄去上清，在45～50℃的中溫水浴中風干DNA沉淀10～15min。
注：當大部分乙醇蒸發時，白色的DNA沉淀變為半透明狀；一定要*清除乙醇，否則會在加入Master Mix后產生微小的沉淀，導致高背景。
1.4 溶解探針
加入5μl 預熱至37℃的去離子甲酰胺（PH 7.0），短時離心后在37 ℃振搖30 min以充分溶解DNA；再加入預熱至37 ℃的Master Mix 5μl，短時離心后在37 ℃振搖15～30 min。
注：振搖時間盡可能延長；DNA沉淀亦可以TE緩沖液1.1 μl溶解后加入Vysis探針緩沖液4.4 μl稀釋，混勻后瞬時離心，37 ℃振搖15～30 min。
1.5 探針的變性和預雜交
短時離心后于80 ℃水浴中變性探針10 min，冰浴5分鐘；短時離心，于37 ℃水浴中預雜交30～60 min；*序列探針（如cDNA）和重復序列探針（如α-衛星DNA）探針，無需預雜交。
2. 標本（染色體靶DNA）的處理和變性
2.1 滴片和老化
取出儲存于-20 ℃的細胞懸液標本，以1100 rpm.離心10 min沉淀細胞，換用適量體積的新鮮甲醇:冰乙醇（v/v）＝3:1固定液重懸細胞并調整細胞密度，滴片，劃出雜交區域，晾干；在預熱到 37 ℃ 的2×SSC中老化30 min（也可實驗前夜室溫老化再以2×SSC浸泡2分鐘）；依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脫水，每缸2min，晾干（以下略作“梯度乙醇脫水后涼干”）。
2.2 RNase A消化
每張玻片上加30 μl 100 μg/ml RNA酶（將10mg/ml的RNase A儲存液稀釋100倍），蓋上22×22 mm蓋玻片，置于37℃濕盒中孵育1小時；室溫下2×SSC中振蕩洗滌，5min/次×3次；梯度乙醇脫水后涼干。
2.3 靶DNA的變性
將玻片放入預溫至72 ℃（每增加一張玻片，溫度要提高1℃）的70 %去離子甲酰胺/2×SSC中變性2分鐘后，立即置入預冷至-20 ℃保存的梯度乙醇脫水晾干。
2.4 蛋白酶消化
將50 μl 100 mg/ml的胃蛋白酶（終濃度為0.01 ％）加入預溫至37℃的50ml蒸餾水（PH 2.0，以適量稀鹽酸酸化）中，混勻；將變性后的玻片放入其中處理10分鐘；室溫下1×PBS中振蕩洗滌，5min/次×2次；室溫下梯度乙醇脫水后涼干。
注：靶DNA的變性和消化應與探針變性同步進行，完成后盡快進行雜交。
3. 雜交
將變性后的DNA探針加于玻片雜交區域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，封片后置于濕盒中，37 ℃雜交。
第三天
1. 雜交后洗滌和半抗原信號放大
1.1 雜交后洗片
小心揭去封片膠和蓋玻片，將玻片置于預熱至46 ℃的50 ％甲酰胺/2×SSC中，5 min×3缸；將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5 min×2缸；每張玻片滴加30 μl阻斷液1，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37 ℃濕盒中孵育30 min；再次將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
注：此后步驟應注意避光操作。
1.2 滴加一抗
將4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育1小時；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
1.3 滴加二抗
將4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育40min；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
1.4 滴加三抗
將4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育30min；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
注：以上步驟按雙色FISH描述，若為單色FISH則選擇相應抗體即可。
2. 核復染和抗熒光淬滅劑封片
將1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中（終濃度為125 ng/ml，避光保存于4℃），混勻；將玻片置于其中，避光復染2min；2×SSC中洗滌5min；梯度乙醇脫水晾干；每張玻片滴加10 μl 抗熒光淬滅劑封片，蓋上22mm×22mm蓋玻片，-20 ℃避光保存。
3. 熒光顯微鏡檢測FISH雜交信號
以熒光顯微鏡觀察，在DAPI/FITC/Texas Red濾光鏡激發下觀察中期/間期細胞的熒光雜交信號，計數細胞和采集圖像。每例分析100～200個間期細胞核細胞，重疊、破損、未去除細胞質和雜交信號微弱的細胞核不計入其中。對于雙色雙融合FISH，細胞內雜交信號相互靠近（<1/10核直徑的距離）者計為一個信號。
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