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DNA實驗技術：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗
更新時間：2013-08-22 瀏覽次數：2365
本方法由于快捷、簡便及具髙分離度，對純化寡核苷酸非常有用。盡管得到率偏低（＜50%），回收的量通常卻大大超過了大多數分子生物學應用所需的量步驟亦可用于分離小RNA或其他單鏈多聚核苷酸。
實驗方法
- 基本方法
| 實驗材料 | 核苷酸 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 濃氨水 TBE 丙烯酰胺 亞甲雙丙烯酰胺 TEMED 尿素 過硫酸銨 TE |
| 儀器、耗材 | 真空旋轉蒸發(fā)儀 電泳儀 |
| 實驗步驟 | 1. 用濃氨水將合成的寡核苷脧從可控孔度玻璃拄上洗脫下來。于55℃加熱5 h 以上。 2. 樣品移至離心管中，在Speedvac真空旋轉蒸發(fā)儀中凍干，沉淀用0.2 ml 的水重懸。 3. 裝好灌膠裝置，準備合適的凝膠溶液（表1）。對于10 cm×16 cm×1.6 mm 大小的凝膠，在一個真空過濾瓶中棍合下列成分： （1）25.2 g 尿素（終濃度7 mol/l） （2）6 ml 10×TBE 電泳緩沖液 （3）40%丙烯酰胺/2%亞甲雙丙烯酰胺溶液（所需量） （4）加水至60 ml （5）脫氣10 min，加入200 μl10%的過硫酸銨及30 μl 的TEMED?；旌虾蠊嗄z，室溫下讓膠聚合30 min 以上。
表1、變性聚丙胺凝膠電泳能使相應片段達到zui適分離度的丙烯酰胺濃度 4. 拔去梳子，將凝膠板固定在電泳槽上，用1×TBE下緩沖液注滿上層及下層槽。 5. 加樣前用2×甲酰胺加樣緩沖液將樣品作對倍稀釋。 6. 每一個2cm×1.6 mm 孔中可以加入2 μmol 合成量的25%。 7. 得到一個清哳的結果約需10 μg（50 μl 重懸樣品+50 μl 2×甲酰胺加樣緩沖液=每孔100 μl）。 8. 臨加樣前用移液器上下吹打TBE緩沖液數次以*洗滌樣品孔。 9. 加樣，在約5 V/cm2電壓降下電泳至溴酚藍到達膠底部。 10. 將凝膠板從電泳槽中取出，水平放置，撬開上層板。 11. 用塑料膜覆蓋凝膠，將板翻轉，將凝膠的一角揭離玻璃板，放在塑料膜上，再用另一張塑料膜覆蓋凝膠。 12. 將凝膠放在帶熒光指示劑的薄層層析板上，用短波紫外燈跟蹤觀察條帶，條帶將在綠色背景下顯示暗跡。 13. 一個干凈的解剖刀將條帶直接切下或用墨水標記后切出，剝去塑料膜，將膠條轉移至離心管中。 14. 每2 cm 的膠條加0.5 ml 的0.3 mol/l 乙酸鈉，室溫下在旋轉揺床上洗脫。 15. 將溶液轉移至一個干凈的離心管中，不要帶入丙烯酰胺碎片。 16. 用等體積的酚抽提1次，氯仿抽提1次，乙醇沉淀，干燥，樣品用TE緩沖液或水重懸。 |
