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技術文章

專題：轉染實驗的注意事項

更新時間：2013-07-08 瀏覽次數：1619

將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉導至真核細胞中的方法主要有以下幾種：

1.磷酸鈣共沉淀

將氯化鈣，RNA（或DNA）和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離*條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。

2.電穿孔法

電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異，據認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優化對于成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。

3.DEAE-葡聚糖和polybrene

帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過使用DMSO或獲得的滲透休克將DNA復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉染。DEAE-葡聚糖于瞬時轉染。

4.機械法

轉染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉入細胞質或細胞核。基因槍使用高壓microprojectile將大分子導入細胞。

5. 陽離子脂質體試劑

在優化條件下將陽離子脂質體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質體。這些脂質體帶正電，可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。因此使用陽離子脂質體轉染的原理與以前利用中性脂質體轉染的原理不同。使用陽離子脂質體試劑，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物。據稱，一個約5kb的質粒會結合2-4個脂質體。被俘獲的DNA就會被導入培養的細胞。現存對DNA轉導原理的證據來源于內吞體和溶酶體。

6. 腺病毒載體

腺病毒由于其基因結構、功能清楚；易于制備、純化、濃縮；宿主范圍廣；感染率高；理化性質穩定；不整合宿主基因組；遺傳毒性和免疫毒性低的特點，成為RNA干擾實驗研究中重要的基因載體系統。Ad2和Ad5是目前應用zui廣的兩種腺病毒血清型。

為了達到高的轉染效率，在轉染實驗過程中，需要注意以下幾點：

1.純化siRNA

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。

4.避免使用抗生素

Ambion公司推薦從細胞種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到*轉染效果。

5.選擇合適的轉染試劑

針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。

6.通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件

對大多數細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。

7.通過標記siRNA來優化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。 

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