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技術(shù)文章

流式表面抗原染色方法

更新時(shí)間:2013-04-24 瀏覽次數(shù):2786

方案A:細(xì)胞懸液的表面抗原染色。
方案B:一步法胞內(nèi)蛋白染色(細(xì)胞核)。

小貼士:
1、流式抗體要儲(chǔ)存于避光4度,嚴(yán)格避免凍融。
2、流式抗體使用前要離心3min,避免貼壁蓋的損失,請(qǐng)勿斡旋混勻。
3、避免細(xì)胞成團(tuán),以免堵塞流式細(xì)胞儀。
4、eFluor納米晶體抗體參照該品說(shuō)明進(jìn)行改善。


 

方案A: 細(xì)胞懸液的表面抗原染色

實(shí)驗(yàn)材料:

15×75mm圓底流式管或96孔板
直標(biāo)一抗或純化抗體
二抗(可選)
抗小鼠CD32/16抗體(eBioscience Cat. No. 14-0161)
人FC?R結(jié)合抑制劑(eBioscience Cat. No. 14-9161)
流式染色液(eBioscience Cat. No. 00-4222)可自行配制
eFluor納米晶體抗體染色液(eBioscience Cat. No. 00-3222;可選)
7-AAD活度染色液(eBioscience Cat. No. 00-6993)或PI染色液(eBioscience Cat. No. 00-6990)

實(shí)驗(yàn)流程:
1、按照樣品細(xì)胞制備方案制備懸浮細(xì)胞,調(diào)整濃度為2×107/ml。
2、(可選)封閉FCR介導(dǎo)的非特異性反應(yīng):
小鼠:染色之前加0.5ug-1ug/100ul CD16/32抗體,孵育20min。
人類(lèi):染色之前加20ul 人FCR結(jié)合抑制劑孵育20min。
3、等分細(xì)胞懸液,每管50ul,再補(bǔ)加50ul染色液。
4、按照抗體說(shuō)明書(shū)加入適量抗體,輕彈混勻。
5、直標(biāo)抗體。


 

方案B:淋巴組織細(xì)胞制備

實(shí)驗(yàn)材料:

60×15mm 的組織培養(yǎng)皿
[5ml 注射器
細(xì)胞過(guò)濾器(尼龍網(wǎng)過(guò)濾)
eBioscience® 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)
15ml或50ml的離心管。

注意:
Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀釋為工作液(1:4稀釋?zhuān)?/a>

實(shí)驗(yàn)方案:
1、按照流式樣品要求制備單細(xì)胞懸液。
2、按照流式表面染色方法標(biāo)記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次,離心*棄上清。斡旋分散細(xì)胞。
3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液,斡旋固定細(xì)胞。室溫或四度避光孵育30-60min(小鼠樣品zui長(zhǎng)可以四度固定18小時(shí))。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室溫離心5min,棄上清。
6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細(xì)胞。
7、300g 室溫離心5min,棄上清。
8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細(xì)胞后,加入二抗FOXP3 (或其他胞內(nèi)抗原抗體),室溫避光孵育20min。
9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次,300g 室溫離心5min,棄上清。
10、加2ml 流式染色液,300g 室溫離心5min,棄上清。
11、適量流式染色液重懸,即可上機(jī)檢測(cè)。同行對(duì)照依照上述步驟進(jìn)行。軟件分析結(jié)

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