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農桿菌感受態細胞制備實驗
更新時間：2013-03-02 瀏覽次數：1978
| 實驗方法原理 | 在基因工程操作中，感受態細胞的制備和質粒的轉化是一項基本技術。感受態是細菌細胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態。農桿菌的感受態可用CaCl2處理而誘導產生。將正在生長的農桿菌細胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會使細菌細胞膜的透性發生改變，此時的細胞呈現出感受態。制備好的農桿菌感受態細胞迅速冷凍于-70℃可保存相當一段時間而不會對其轉化效率有太大的影響。 |
| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 一、實驗儀器、材料和試劑 1. 儀器
超凈工作臺，恒溫搖床，冷凍高速離心機，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低溫冰柜，分光光度計，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進樣器及吸頭。 以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15分鐘。 2. 材料
土壤農桿菌LBA4404菌株或其它農桿菌菌株 3. 試劑
（1）YEB液體培養基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，高壓滅菌。 （2）利福平（Rif）儲液：50 mg/ml （3）20 mM CaCl2，高壓滅菌。 二、實驗步驟 1. 挑取根癌農桿菌LBA4404單菌落于3 ml的YEB液體培養基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振蕩培養過夜。 2. 取過夜培養菌液1 ml接種于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液體培養基中，28℃振蕩培養至OD600為0.5。 3. 取2 ml菌液，13 000 rpm，離心30 sec，棄上清。 4、加入1000 μl 20 mM CaCl2，使農桿菌細胞充分懸浮，冰浴30 min。 5、13 000 rpm，離心30 sec，棄上清，置于冰上，加入500 μl預冷的20 mM CaCl2，充分懸浮細胞，冰浴中保存，24 hr內使用，或液氮中速凍1 min，置-70℃保存備用。 收起 |
| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 一、試劑配制
1 mM HEPES的配制：稱取0.119 g HEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500 ml，用NaOH調pH至7.0，滅菌后待用。
二、實驗步驟
1. 挑取單克隆接種于2 ml YEP（含50 mg/l鏈霉素）液體培養基，28℃，250 rpm，振蕩培養過夜。（如用5 mlYEP，需培養36 h） 2. 將菌液按1:100轉移至200 ml YEP（含50 mg/l鏈霉素）培養液中，28℃，250 rpm，振蕩培養至OD=0.3（約4~5 h）。 3. 轉入50 ml的無菌離心管，4℃，4 000 rpm離心10 min，棄上清。 4. 用20 ml冰浴的HEPES（1 mM，PH7.0）重懸。 5. 4℃，4 000 rpm離心10 min，棄上清。 6. 重復4、5步驟2~3次。 7. 用2 ml冰浴的10%甘油重懸。 8. 每管100 μl分裝于1.5 ml無菌的Eppendorf管中，-70℃保存。 展開 |
| 注意事項 | 1. HEPES需現用現配。 展開 |
snokey: 農桿菌轉化注意事項
農桿菌轉化注意事項： 1. 感受態盡量新，而且不要太濃（0.3-0.5）； 2. CaCl2盡量新； 3. 涂板只加Kan 50mg/L，等出了菌落再加到100mg/L； 4. pBI121本身拷貝數低，轉化子可能長的就慢些； 5. LB營養沒有YEP豐富，其實關系不大； 6. 4404不好用，能用105就不要用4404，105轉化效率通常比4404好的多 。
發表于2006-08-01 23:17
seesky: 農桿菌質粒提取和酶切問題
從農桿菌中可以抽出質粒，但做不了酶切試驗，原因是： 1. 量太少，主要是菌裂解困難，以及農桿菌雙元載體攜帶的是低拷貝復制子； 2. 雜質太多，酶切后呈現smear帶，無法判斷是否有目標基因。