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10×擴增緩沖液 　   10 ul

 

4種dNTP混合物 　 各200 umol/L

 

引物 　　　　 　     各10～100 pmol

 

模板DNA 　　　 　0.1～2 ug

 

Taq DNA聚合酶 　  2.5 u

 

Mg²⁺　　　　　　 1.5 mmol/L

 

加雙或三蒸水至 　  100 ul

 

二、PCR引物設計

PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

1.   引物設計的基本原則

（1）  引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右。

（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（3） 引物內部不應出現互補序列。

 

（4）兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

 

（5） 引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有*互補序列，否則易導致非特異性擴增。

 

（6）引物3‘端的堿基，特別是zui末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，*選擇是G和C。

（7） 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

2.   引物設計軟件

Primer Premier5.0 （自動搜索）*、Oligo6 （引物評價）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在線服務）。

三、模板的制備

（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

（2）模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。

（3）標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。

四、PCR反應條件的控制

1.  PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。 

2.  鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。

　　
3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。

　
4.  TaqDNA聚合酶2.5U（100 ul）。

　　
5.  引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。

　
6.  反應溫度

（1）變性溫度和時間95℃，30 s。

（2）退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸溫度和時間72℃，1 min/kb（10 kb內）。

（4）Tm值=4（G+C） +2（A+T）

7.  循環次數 ：一般為25 ～30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低，可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數并不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右，循環數超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產物的量不再隨循環數的增加而增加，出現了所謂的“平臺期”。

五、PCR的循環參數
 
1.  預變性（Initial denaturation）

模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

2.  循環中的變性步驟

循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不*，易造成擴增失敗。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進行（Taq酶zui適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略

延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp。

5.  循環數

大多數PCR含25-40循環，過多易產生非特異擴增。

6.  zui后延伸

在zui后一個循環后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸*，并使單鏈產物退火成雙鏈。

六、PCR步驟
 
1.  DNA變性

（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2.  退火

（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.  延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性*）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

七、PCR檢測
 
PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是zui常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。